衛(wèi) 瑩,朱 靖,王青元,范少君,李 敏,肖衛(wèi)華,凌 斌,周 穎

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科分子實驗室安徽省分子醫(yī)學重點實驗室,安徽合肥230001;2.中國科技大學生命科學院免疫學研究所)

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的最重要危險因素之一,高危型HPV,如HPV16和18的感染在宮頸癌中最常見,其E6基因及產(chǎn)物常常導致細胞基因失活、變異和異常表達,最終誘導宮頸上皮細胞永生化,是最主要的癌蛋白編碼基因[1]。近年來對E6蛋白的研究逐步深入,但是E6蛋白在子宮頸癌細胞株中的表達水平很低,很難檢測[2]。本文將HPV18E6基因克隆到3×flag真核表達載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6,經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)染到Hela細胞中,為進一步研究HPV18E6在宮頸癌發(fā)病中的作用奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TakaRa公司,DEPC購自Sigma公司,TaqDNA聚合酶購自 TakaRa公司,pMDTM18-T Vector購自TaKaRa公司,小劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司,限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SalⅠ及DNA連接酶均購自Fermentas公司,大腸肝菌菌株E.coli DH5α購自上海生工生物工程有限公司,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen公司,HPV18E6抗體購自santa cruz公司,GAPDH抗體購自Cell signaling公司,flag抗體購自sigma公司,Western-blot化學發(fā)光底物購自PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表達載體的構(gòu)建及鑒定 參考GenBank中HPV18E6堿基序列,采用Primer Premier 5.0軟件進行分析后設計出18E6上下游引物:P1:GCGCGCTTTGAGGATCCAA;P2:TTATACTTG T GTTTCTCTGCGTCG.Fw1:CCCaagctt GCGCGCTTTGAGGATCCAA(HindⅢ);Rv1:GCGTCGAC TACTTGTG TTTCTCTGCGTCG(SalⅠ);分別加入了HindⅢ、SalⅠ酶切位點(劃線部分)。用Trizol法從Hela細胞中提取總RNA,以Oligod(T)18為逆轉(zhuǎn)錄引物,以提取的總RNA為模板,在M-mlv反轉(zhuǎn)錄酶催化下反轉(zhuǎn)錄出cDNA。取 2 μ l cDNA為模版,采用Takara Ex TaqDNA聚合酶進行PCR,擴增目的基因。反應條件:94℃5 min 1個循環(huán),94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s共35個循環(huán),72℃10 min 1個循環(huán)。取15 μ l PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳。依據(jù)TaKaRa膠回收純化試劑盒操作規(guī)程,膠回收純化目的片段,回收成功后將目的片段連接到pMD-18T載體中,轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒測序鑒定正確后,以pMD-18T-18E6為模板,經(jīng)Fw1,Rv1引物擴增得到編碼區(qū)片段。將18E6編碼區(qū)片段與載體分別用HindⅢ、SalⅠ酶切,膠回收獲得載體片段和HPV18E6片段,然后用DNA連接酶,20℃連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進DH5α感受態(tài)大腸桿菌,涂板(氨芐霉素抗性),37℃生長16 h-24 h,長出菌斑約100個,挑出14個菌斑溶于1 ml氨芐霉素抗性的LB培養(yǎng)基中少量搖菌12 h,取2 μ l作為模板進行PCR,有四個克隆擴增出HPV18E6片段,陽性的菌液加入氨芐霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩搖菌,37℃過夜。參照Axygen質(zhì)粒小量提取試劑盒操作規(guī)程提取純化p3×flagmyc-CMV-24-HPV18E6,HindⅢ、SalⅠ酶切質(zhì)粒,電泳鑒定,鑒定證實后的細菌擴增培養(yǎng),提取質(zhì)粒,送到上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞 將人子宮頸癌細胞株Hela種到 6孔板中,每孔2×105,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后用DMEM 洗滌2次,分別將p3×flagmyc-CMV-24-HPV18E6質(zhì)粒、p3×flag-myc-CMV-24對照質(zhì)粒各 4 μ g,脂質(zhì)體 Lipofectamine2000 10 μ l/孔 。轉(zhuǎn)染6 h后,更換完全培養(yǎng)基,48 h后收取細胞。

1.2.3 蛋白的提取及Western-blot檢測 收取轉(zhuǎn)染細胞,冷PBS洗3次后,加入30 μ l RIPA(臨用前加入PMSF、抑蛋白酶肽)冰上30 min,4℃12 000 rpm離心30 min,移上清至一新的微量離心管,蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳,再電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,經(jīng)封閉2小時后一抗 flag(1∶1 000)或 GAPDH(1∶1 000)或HPV18E6(1∶50)4℃過夜,TBS-T洗后加入相應的二抗孵育2小時,膜經(jīng)TBS-T洗后與ECL發(fā)光檢測劑結(jié)合,經(jīng)X片壓片曝光,顯示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HPV18E6的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 DNA marker為DL2000標準參照物,PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示在500 bp的一條特異性目的片段,與所設計的HPV18E6目的基因片段大小一致(圖1)。

圖1 HPV18E6目的基因片段電泳圖

2.2 p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6重組質(zhì)粒酶切鑒定、測序 經(jīng)HindⅢ和SalⅠ雙酶切后出現(xiàn)分子量分別為4 700 bp和500 bp的2條帶,正好與質(zhì)粒p3×flag-myc-CMV-24和HPV18 E6基因的分子量一致(圖 2)。將重組質(zhì)粒 p3×flag-myc-CMV-24-HQV18E6送到上海生工生物有限公司測序,測序結(jié)果均與目的序列完全相同,表明構(gòu)建載體成功。

圖2 HPV18E6目的基因片段電泳圖及p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6酶切鑒定

2.3 p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞后,E6蛋白和flag標簽的表達情況p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞48 h后,Western blot檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組E6蛋白顯著升高并可檢測到flag標簽(圖3)。

圖3

3 討論

目前,子宮頸癌發(fā)病率居高不下,且發(fā)病年齡趨于年輕化,宮頸癌發(fā)病與人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染密切相關,HPV為雙鏈環(huán)狀DNA,其片段長度約為8.0 kb,編碼6個早期蛋白和2個晚期蛋白,HPV通過抑制一系列的靶蛋白,如腫瘤抑制因子,避免了被感染細胞的凋亡,從而使細胞處于永生化狀態(tài)[3、4]。其中 E6、E7是HPV 致癌的關鍵分子,在宮頸癌組織中持續(xù)表達,能促使宿主細胞進入增殖周期而導致細胞復制,在細胞惡性轉(zhuǎn)化中起關鍵作用。HPV E6蛋白由151個氨基酸殘基組成,含有2個鋅指結(jié)構(gòu),每個鋅指結(jié)構(gòu)含有2個C-X-X-C序列,鋅指結(jié)構(gòu)是E6發(fā)揮功能所必需的[5]。高危型HPV E6與E7相互作用使人類的角質(zhì)形成細胞永生化,并通過作用于ras致癌基因從而使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[6]。E6蛋白是HPV感染過程中最早表達的蛋白之一,通過招募E6AP泛素酶形成復合體,然后與p53核心部分相結(jié)合,E6將活化的泛素轉(zhuǎn)移到p53蛋白,p53進行泛素化降解,使p53蛋白控制的G1/S節(jié)點失去控制,導致細胞染色體不穩(wěn)定和基因突變增加以及外源DNA整合到染色體中機率大大升高[7、8]。此外,E6還可與細胞內(nèi)許多蛋白相互作用而協(xié)同參與細胞轉(zhuǎn)化過程:如抑制宿主細胞凋亡、激活端粒酶等對宮頸癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化及細胞永生化過程有重要作用[9]。但由于E6蛋白在子宮頸癌細胞株Hela細胞中的表達水平太低,很難用Westernblotting等方法檢測[2],阻礙了我們對其致癌機制的進一步研究。

隨著組蛋白學的迅速發(fā)展,重組蛋白質(zhì)的應用近年來大大增加,重組蛋白雜合體含有一個多肽融合擔體也就是親和標簽可用于輔助目標蛋白的檢測。Flag標簽系統(tǒng)是利用一短的親水8氨基酸肽并融合到目標蛋白,常標記于重組蛋白質(zhì)的氨基端以幫助分析靶蛋白的生物學功能,并且可以用專門的單抗進行檢測[10]。為了進一步提高flag標簽的檢測能力,目前常用3×flag標簽系統(tǒng),這一三聯(lián)體flag抗原表位是親水性的,由22個氨基酸組成,可以檢測表達低至10 fmol水平的融合蛋白。而且研究發(fā)現(xiàn)使用這些很小的肽標簽不會對融合蛋白質(zhì)的功能及定位發(fā)生干擾。此外,含CMV啟動子可以高效啟動目的蛋白在細胞中的表達,進一步有助于目的蛋白的檢測。

本實驗中利用親和標簽flag對目的蛋白進行檢測和監(jiān)測的方法,將已合成的p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6質(zhì)粒導入子宮頸癌細胞株Hela細胞中,并對其蛋白復合物進行檢測,不僅提高了E6蛋白的表達量,通過flag標簽系統(tǒng)使得E6蛋白更易于檢測,為進一步研究HPV18E6蛋白及其復合物的結(jié)構(gòu)功能及其在子宮頸癌中所發(fā)揮的作用奠定了基礎。

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