賈贊慧,鄭桂英,崔滿華*,孫 琳,范艷艷

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)化學(xué)系;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1a)在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)狀態(tài),這種表達(dá)與腫瘤的分化程度、預(yù)后有關(guān)[1]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮細(xì)胞合成和表達(dá)的IGF-1a參與子宮內(nèi)膜的增生和分化以及淋巴轉(zhuǎn)移[2]。在進(jìn)行IGF-1a與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系研究過(guò)程中,需要提供大量IGF-1a蛋白質(zhì),本實(shí)驗(yàn)采用用分子克隆技術(shù)正確克隆及表達(dá)IGF-1a,為探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療中的意義提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ),現(xiàn)將該基因的克隆、表達(dá)及純化過(guò)程報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 NcoⅠ和 XhoⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自TakaRa公司;Taq DNA 聚合酶 、dNTP、oligo-dT、10 ×PCR緩沖液、T4連接酶購(gòu)自美國(guó) Promega公司;RNase、卡那霉素及氨芐青霉素購(gòu)于華美生物工程公司;IPTG購(gòu)自Sigma公司。pET表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Novagen公司。pMD18-T vector購(gòu)自TakaRa公司;大腸桿菌菌種BL21由本室保存。DNA marker購(gòu)自華美生物工程公司,引物由上海生物工程公司合成。

1.2 pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒的構(gòu)建①IGF-1a基因的獲取:用所合成的引物進(jìn)行五重PCR擴(kuò)增,五對(duì)引物為:第一對(duì)引物共設(shè)計(jì)5對(duì)引物,各對(duì)引物順序均從 5'到3',第一對(duì)引物GCTCTTCACTTCGTGTGTCGACCGAGGGGCTTTTACTTC AACAAGCCCACAGGCTATG(58 bp)和CACTCATCCACAATCCCTGTCTGAGGTGCCCTCCGAATGCTGGAGCCA TAGCCTGTGG(58 bp);第二對(duì)引物CACTACAGCCGGACCAGAGACCCTTTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCT CTTCACTTC( 58 bp)和CACAGTACATCTCCAGTCTCCT CAGATCACAGCTCCGGAAGCAACACTCATCCACAATC-(58 bp);第三對(duì)引物為CACACCTGTTCTACCTGGCGTCTGCTTGCTCACCTTCACCAGCTCCACTACAGCCCGG(58 bp)和GTTGGGCACGGATAGAGCGGGCTGCTTTTGTAGGCTTCAGTGGGGCACAGTACATCTC(58 bp);第四對(duì)引物CTGCCTCTGTGACTTCTTGAAGATAAAGATACACATCATGTCGTCTTCACACCTGTTC(58 bp)和TTCAAATGTACTTCCTTCTGAGTCTTGGGCATGTCAGTGTGGCGTTGGGCACGGATAG (58 bp);第五對(duì)引物CCATGGGGAAAATCAGCAGCCTTCCAACTCAATTATTTAAGATCTGCCTCTGTGAC(56 bp)和CTCGAGCATTC-TGTAGGTCTTGTTTCCTGCACTTCCTCTACTTGTGTTCTTCAAATGTACTTC(63 bp)。②pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒的獲得:將PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段以NcoI和XhoI切點(diǎn)定向克隆入pET28a表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)。取經(jīng)卡那霉素平板篩選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng),提取質(zhì)粒。采用相同酶切后,用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆。然后由上海生物工程公司對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 IGF-1a的表達(dá)和純化 ①陽(yáng)性重組克隆的篩選:將pET28a轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)涂于含卡那霉素的LB平板上。分別挑取單克隆,加人適量的LB培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,用堿裂解法制備質(zhì)粒,pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒用NcoI和XhoI雙酶切及2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定,釋放出長(zhǎng)度約為481 bp的片段的菌落為陽(yáng)性重組克隆。利用載體多克隆位點(diǎn)的上游序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物,由本室AB1310DNA序列自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)序鑒定。②表達(dá):挑取含pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒的單菌落,生長(zhǎng)于含有50 g/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。菌液在三角燒瓶中于37℃、200 r/min的恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)至A600值為0.5-1.0,然后用0.1%IPTG于37℃誘導(dǎo)3 h。離心收集菌體進(jìn)行SDSPAGE分析,在相對(duì)分子質(zhì)量約15 kd的位置上有明顯表達(dá)條帶的為陽(yáng)性克隆。③表達(dá)產(chǎn)物的純化:離心收獲大腸桿菌并將其懸于含2 mmol/L PMSF的溶液中,超聲破碎裂菌。將細(xì)菌裂解液裝人鎳離子鰲合瓊脂糖凝膠-4B柱上。層析柱用1%Tritonx-100充分洗滌以去除內(nèi)毒素,被結(jié)合的蛋白質(zhì)用50 mmol/L的咪唑洗脫,然后用Q-瓊脂糖凝膠柱進(jìn)一步純化,貯存于-70℃。通過(guò)SD-SPAGE和凝膠掃描儀分析純度。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

第1個(gè)PCR應(yīng)合成104 bp片段,第2個(gè)PCR應(yīng)合成194 bp片段,第3個(gè)PCR應(yīng)合成285 bp片段,第4個(gè)PCR應(yīng)合成378 bp片段,第5個(gè)PCR應(yīng)合成481 bp片段,5次PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與實(shí)際堿基對(duì)數(shù)相符,見(jiàn)圖1。

2.2 pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒NcoⅠ和XhoⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳

在1 000-2 000 bp可見(jiàn)一條明亮電泳帶,與實(shí)際堿基對(duì)數(shù)(467 bp)相符,見(jiàn)圖2。上海生物工程公司測(cè)序結(jié)果表明,重組質(zhì)粒中IGF-1堿基序列正確。

2.3 IGF-1蛋白表達(dá)純化產(chǎn)物SDS-PAGE

重組蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到菌體蛋白的60%以上;純化后重組蛋白的純度可達(dá) 98%以上,見(jiàn)圖3。

圖1 IGF-1 5重PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 2%瓊脂糖凝膠電泳分析

圖3 IGF-1a蛋白表達(dá)純化產(chǎn)物圖

3 討論

近年來(lái)IGF-1a在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用上的重要性倍受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外有多家實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了重組IGF-1a的研制工作,所用的克隆方法及表達(dá)系統(tǒng)也各不相同,既有大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),也有酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)[3,4]

本研究通過(guò)多重PCR方法成功克隆了IGF-1a目的基因,并構(gòu)建了pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)了外源蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE電泳分析表明,該外源蛋白是IGF-1a基因的表達(dá)產(chǎn)物,并且通過(guò)鎳金屬鰲合親和層析,獲得了高純度的目的蛋白。

多重PCR(multiplex PCR)是在同一試管中加入多對(duì)引物,擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)域,可一次性篩選出目的DNA,具有檢測(cè)的覆蓋面較廣、效率較高、費(fèi)用相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)[5],本研究選用的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)在基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛,與其他系統(tǒng)相比具有遺傳背景清楚、繁殖快、表達(dá)效率高及抗污染能力強(qiáng)[6],提高目的蛋白表達(dá)量,方便下游蛋白純化等優(yōu)點(diǎn)[7]。pET28a(+)原核表達(dá)載體含有能被T7 RNA聚合酶特異性識(shí)別的T7強(qiáng)啟動(dòng)子[8]。將外源基因置于T7啟動(dòng)子控制下,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能夠高效表達(dá)外源蛋白。從圖3可以看出,重組蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到菌體蛋白總量的60%以上,重組蛋白的純度可達(dá)98%以上,完全能滿足下游實(shí)驗(yàn)的要求,從而為探索IGF-1與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[2]研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]吳君心,余子豪,鄭天榮,等.胰島素樣生長(zhǎng)因子受體與乳腺癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志,2000,9:91.

[2]O'TOOLE S A,DUNN E M.Oestrogen regulated gene expression in nomal and malignant endometrial tissue[J].Maturitas,2005,51(2):187.

[3]岳鳳鳴,趙煥英,楊 慧,等.F人胰島素樣生長(zhǎng)因子89基因的克隆表達(dá)和活性檢測(cè)[J].解剖學(xué)報(bào),2003,34(3):306.

[4]賴心田,周 鵬,洪 葵.人胰島素樣生長(zhǎng)因子1在畢赤酵母中表達(dá)的研究[J].藥物生物技術(shù),2002,9(3):133.

[5]Verhagen OJ,Willemse MJ,Breunis WB,et al.Application of germline IGH probes in real time quantitative PCR for the detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2000;14:1426.

[6]李育陽(yáng).基因表達(dá)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:1-13.

[7]Yoon S J,Park JW,Ahn SYetal.DNA-mediated immunization of mice with plasmid encoding HBs antigen[J].J Korean Med Sci,1999,14(2):187.

[8]陳長(zhǎng)征,段治軍,楊新穎,等.T7啟動(dòng)子控制下的多功能大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),1996,28(5):531.