趙東波,孫鴻斌,李春雨,崔樹(shù)森

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手外科,吉林長(zhǎng)春130033)

周?chē)窠?jīng)損傷實(shí)質(zhì)上是神經(jīng)細(xì)胞軸突的損傷,必然影響相應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞的存活和功能狀況,從而影響神經(jīng)軸突的再生和功能恢復(fù)。因此,研究周?chē)窠?jīng)再生和功能恢復(fù)的重點(diǎn),應(yīng)從神經(jīng)胞體的功能狀況、軸突再生的影響因素和效應(yīng)器的恢復(fù)潛能等方面綜合研究[1]。關(guān)于周?chē)窠?jīng)損傷后,相應(yīng)脊髓節(jié)段運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)是否明顯活化以發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用,以及損傷后不同時(shí)相表達(dá)水平的變化報(bào)道較少。本研究采用大鼠坐骨神經(jīng)切斷的動(dòng)物模型,通過(guò)TUNEL法和免疫組化染色法檢測(cè)相應(yīng)節(jié)段神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與試劑

健康雄性Wistar大鼠35只,體重250-300 g(吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室),隨機(jī)分為假手術(shù)組(5只)和損傷組(30只)。實(shí)驗(yàn)組再分為六個(gè)小組,每組5只。實(shí)驗(yàn)組于傷后3天,1周,2周,4周,6周和8周6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材。主要試劑:鼠抗鼠Bcl-2抗體、鼠抗鼠Bax抗體(中山生物技術(shù)有限公司),TUNEL試劑盒,SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.2 模型制備、取材與固定

10%的水合氯醛3ml/kg對(duì)大鼠腹腔麻醉,術(shù)區(qū)常規(guī)消毒,做右側(cè)臀部斜行切口,切開(kāi)皮膚,鈍性分離肌肉,顯露坐骨神經(jīng)。假手術(shù)組暴露坐骨神經(jīng)后逐層縫合皮膚。實(shí)驗(yàn)組在梨狀肌下緣處將坐骨神經(jīng)完全切斷,在12倍手術(shù)顯微鏡下,將其兩端正確對(duì)位后,9-0無(wú)損傷線(xiàn)吻合斷端4針,閉合創(chuàng)口,制成坐骨神經(jīng)切斷模型。取材:將各時(shí)間點(diǎn)5只大鼠腹腔麻醉后,4%多聚甲醛緩沖液心臟灌注固定,切取L4-L6段脊髓,置于5ml 4%多聚甲醛緩沖液中固定,脫水后石蠟包埋,制成厚度為3 μ m的連續(xù)橫斷切片備用。免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá),TUNEL法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡,使用濃度及方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)配置。

1.3 陽(yáng)性結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

從假手術(shù)組及損傷后各時(shí)間點(diǎn)組隨機(jī)選取5張切片,在顯微鏡下觀(guān)察Bcl-2、Bax免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞在各組大鼠脊髓的分布,通過(guò)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析,以平均光度作為Bcl-2、Bax表達(dá)的定量指標(biāo),以數(shù)密度作為T(mén)UNEL法檢測(cè)的定量指標(biāo)。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,運(yùn)用單因素方差分析檢驗(yàn)Bcl-2及Bax表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)數(shù)值的不同是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并對(duì)Bcl-2/Bax值與細(xì)胞凋亡數(shù)之間進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL染色結(jié)果

陽(yáng)性細(xì)胞的胞核呈暗褐色。傷后3天時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較為稀疏,2周時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞最為稠密,圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示,凋亡細(xì)胞的數(shù)密度在3天開(kāi)始上升,2周時(shí)達(dá)高峰,以后有所下降,8周時(shí)仍有少量凋亡細(xì)胞。(見(jiàn)表1和圖3-4)

2.2 Bcl-2、Bax 表達(dá)結(jié)果

Bcl-2和Bax陽(yáng)性定位于胞漿,呈棕黃色,核不著色。假手術(shù)組均未見(jiàn)明顯表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組均于損傷后3天見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組于3天開(kāi)始表達(dá)量逐漸增高,2周時(shí)達(dá)高峰,此后逐漸下降,8周時(shí)仍有表達(dá)。(見(jiàn)表1和圖1-2)

2.3 Bcl-2與Bax比值

Bcl-2與Bax比值均先下降,2周時(shí)達(dá)到最低值,然后逐漸增高。各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2與Bax比值進(jìn)行方差分析,結(jié)果顯示,2周時(shí)Bcl-2與Bax比值的降低與其它組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見(jiàn)表1和圖5)

表1 大鼠坐骨神經(jīng)切斷傷后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2/Bax與凋亡細(xì)胞數(shù)密度值(n=5,±s)

表1 大鼠坐骨神經(jīng)切斷傷后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2/Bax與凋亡細(xì)胞數(shù)密度值(n=5,±s)

Bcl-2/Bax比值與其它時(shí)間點(diǎn)比較,*P＜0.05

Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax TUNEL 3 d0.213±0.0130.175±0.0191.217±0.017 0.92±0.22 1 w 0.217±0.0210.181±0.0161.199±0.005 4.69±0.24 2 w 0.227±0.0120.199±0.0211.141±0.019*10.49±0.24 4 w 0.203±0.0090.169±0.0081.201±0.010 6.38±0.17 6 w 0.201±0.0110.165±0.0181.218±0.027 5.29±0.09 8 w 0.199±0.0120.163±0.0191.221±0.021 4.36±0.16

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后兩周Bcl-2的免疫組化染色(×200)

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后兩周 Bax的免疫組化染色(×200)

圖3 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后兩周脊髓神經(jīng)元凋亡的免疫組化染色(×200)

圖4 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后不同時(shí)間點(diǎn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡計(jì)數(shù)

圖5 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2/Bax平均光度比值

3 討論

周?chē)窠?jīng)損傷后脊髓及背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元的存活與功能狀態(tài)是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。凋亡是神經(jīng)元死亡的重要形式。Atlasi等[2]將Wistar大鼠坐骨神經(jīng)切斷后,用外膜縫合法縫合,術(shù)后1周和12周通過(guò)免疫熒光和電鏡觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)腰5背根神經(jīng)節(jié)中的感覺(jué)神經(jīng)元有數(shù)量的減少和凋亡形態(tài)的改變。各種不同原因?qū)е碌闹車(chē)窠?jīng)損傷,脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元均存在不同程度的凋亡[3]。Bcl-2和Bax是互相拮抗的兩個(gè)基因,在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)是主要的抗凋亡基因,可以抑制多種途徑的凋亡。Bax(bcl-2 associated X protein)屬于Bcl-2基因家族的成員,是Bcl-2的拮抗基因,通過(guò)編碼相應(yīng)功能蛋白而起作用[4]。Bax存在于胞漿中,接受凋亡信息后能夠被激活,激活后通過(guò)末端疏水結(jié)構(gòu)域錨定在線(xiàn)粒體膜上,使線(xiàn)粒體通透性發(fā)生改變致使細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)和凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptic protease activating factor-1,Apaf-1)釋放,進(jìn)而激活caspase系統(tǒng),促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)Bax通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)與Bcl-2形成復(fù)合體后則失去了改變線(xiàn)粒體膜通透性的作用而不能誘發(fā)細(xì)胞凋亡[5][6]。細(xì)胞是否凋亡還與Bcl-2和Bax比值相關(guān)。當(dāng)Bcl-2、Bax基因啟動(dòng)后,表現(xiàn)哪一方面的作用,主要依靠Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量的多少[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:假手術(shù)組Bcl-2、Bax均未見(jiàn)明顯著色,說(shuō)明Bcl-2、Bax的表達(dá)與大鼠坐骨神經(jīng)損傷密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)均經(jīng)歷一個(gè)先增高后下降的過(guò)程。傷后3天時(shí)即有Bcl-2、Bax表達(dá)并開(kāi)始增高,于2周時(shí)達(dá)高峰,以后逐漸下降。我們看到隨著坐骨神經(jīng)切斷損傷時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元細(xì)胞受損加重,凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng),Bcl-2、Bax表達(dá)上升并于同一時(shí)間達(dá)到峰值。Bcl-2與Bax表達(dá)量的平衡變化與細(xì)胞凋亡的發(fā)生與否直接相關(guān)。Bcl-2與Bax比值結(jié)果顯示:各時(shí)間點(diǎn)中,3天時(shí)比值開(kāi)始逐漸減小,2周時(shí)Bcl-2與Bax比值最小,以后比值逐漸增大。TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):傷后3天即可見(jiàn)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞,2周時(shí)最多,以后逐漸下降,8周時(shí)偶可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。Bcl-2和Bax比值與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果相比較,顯示出該比值與神經(jīng)凋亡呈現(xiàn)出規(guī)律性的同步變化。本研究提示:大鼠坐骨神經(jīng)切斷后相應(yīng)脊髓節(jié)段內(nèi)存在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,Bcl-2和Bax比值的變化是神經(jīng)凋亡的重要指標(biāo)。

[1]楊 萍,應(yīng)大君,宋 林,等.成年大鼠坐骨神經(jīng)切斷后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡方式的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(6):146.

[2]Atlasi MA,Mehdizadeh M,Bahadori MH,et al.Morphological identification of cell death in dorsal root ganglion neurons following peripheral nerve injury and repair in adult rat[J].Iranlan biomedical,2009,13(2):65.

[3]Gu ZZ,Pan YC,Cui JK,et al.Gene expression and apoptosis in the spinal cord neurons after sciatic nerve injury.Neurochem Int 1997,30:417.

[4]Nesic-Taylor O,Cittelly D,Ye Z,et al.Exogenous Bcl-xL fusion protein spares neurons after spinal cord injury[J].J Neurosci Res,2005,79(5):628.

[5]Antignani A,Youle RJ.How do Bax and Bak lead to permeabilization of the outer mitochondrial membrane?[J].Curr Opin Cell Biol,2006,18(6):685.

[6]Er E,Oliver L,Cartron PF,et al.Mitochondria as the target of the proapoptotic protein Bax[J].Biochim Biophys Acta,2006,1757(9-10):1301.

[7]Reed JC.Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins:mechanisms,physiological roles,and therapeutic opportunities[J].Cell Death Differ,2006,13(8):1378.