趙程程,范東燕,葉海青

(1.吉林大學農(nóng)學部畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春 130062;2.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室,吉林長春 130021;3.吉林大學農(nóng)學部食品質(zhì)量與安全系,吉林長春 130062)

大鼠胰腺間充質(zhì)干細胞的分離鑒定及體外誘導成脂和成骨研究

趙程程1,范東燕2,葉海青3*

(1.吉林大學農(nóng)學部畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春 130062;2.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室,吉林長春 130021;3.吉林大學農(nóng)學部食品質(zhì)量與安全系,吉林長春 130062)

從新生大鼠胰腺中分離出間充質(zhì)干細胞(MSCs),研究其分化潛能,為胰腺疾病的干細胞移植治療探尋新的細胞來源。無菌條件取出新生3 d的大鼠胰腺,通過Ⅴ型膠原酶消化獲得細胞,常規(guī)培養(yǎng)傳代、貼壁篩選法純化細胞、吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)、流式細胞儀測定表面標志CD34和CD44;用成骨、成脂誘導劑鑒定其分化潛能。結(jié)果顯示,純化細胞在成骨誘導劑作用下被誘導成成骨細胞,在成脂誘導劑作用下被誘導成脂肪細胞。證明所純化的細胞為尚未分化的基質(zhì)細胞,而不是組織的成體細胞,它具有多向分化潛能。

大鼠;胰腺;間充質(zhì)干細胞;分化潛能;誘導

干細胞(stem cell,SC)是指具有自我更新能力與多向分化潛能的幼稚細胞,能在適當微環(huán)境下形成多種組織和器官[1]。在個體發(fā)育過程中,胚胎干細胞[2]能夠分化成機體各種類型的多能干細胞,以及各種組織中的定向干細胞。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞,廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富。近年報道從早產(chǎn)胎兒臍帶血[3]、臍帶靜脈內(nèi)皮下層[4]、肝臟、皮膚、骨膜、肌腱、脂肪組織等均分離到MSCs。MSCs還具有明顯的可塑性,而且易于分離、培養(yǎng)、擴增,易于外源基因的導入和表達,遺傳背景相當穩(wěn)定[5]。由于MSCs的這些特性,使得其在組織工程創(chuàng)傷修復、細胞替代治療、支持造血、基因治療等方面的應用前景相當廣闊。從大鼠胰腺分離MSCs國內(nèi)外鮮有報道,尚未見大鼠胰腺MSCs誘導分化的研究報道。本文從新生大鼠胰腺分離純化間充質(zhì)干細胞,通過應用成骨和成脂誘導劑對其進行誘導,觀察其對誘導劑的反應,進一步對其細胞來源進行鑒定,并對其分化特性進行研究,為胰腺疾病的干細胞移植治療探尋新的細胞來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3 d齡內(nèi)的新生Wistar大鼠10只,吉林大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清,β-磷酸甘油鈉(β-GP),Ⅴ型膠原酶(Sigma),ALP試劑盒(博士德公司),胰島素(丹麥公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胰腺MSCs的分離、擴增及鑒定 將新生大鼠脫臼處死,750 mL/L酒精浸泡消毒3 min,無菌取出胰腺,去除網(wǎng)膜,脂肪,經(jīng)4 ℃Hank's液漂洗2次～3次,用眼科剪剪成組織碎片,Hank's液漂洗3次后加5倍體積Ⅴ型膠原酶(pH 7.4)混勻,37℃水浴震蕩8 min～10 min,至消化液渾濁時自然沉淀吸取上層消化液,迅速用4℃冷 Hank's液終止消化。剩余未消化組織補加消化液繼續(xù)消化,重復4次～5次。收集消化液1 000 r/min離心5 min,沉淀細胞以1×106mL接種于含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基,37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)18 h后,用彎頭吸管輕輕吹打瓶壁,棄去懸浮細胞和半貼壁細胞(實質(zhì)細胞),將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3 d換半液。當細胞達80%融合時,2.5 g/L胰酶消化,常規(guī)傳代,取第3代培養(yǎng)細胞爬片,用吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)。用美國B-D公司生產(chǎn)的FACScan流式細胞儀直接熒光法,通過檢測細胞表面標志CD34、CD44鑒定胰腺MSC。其中激發(fā)光源為15 mW 氬離子激光,波長488 nm。FACS軟件收集細胞,Lysis軟件分析處理數(shù)據(jù),記錄陽性細胞百分率。

1.2.2 成骨誘導

1.2.2.1 誘導方法 將融合生長的第3代細胞消化記數(shù),以相同種植密度5×103/mL種于24孔板中,常規(guī)培養(yǎng)和在培養(yǎng)液中分別加入成骨誘導劑-地塞米松、β-甘油磷酸鈉和 L-抗壞血酸(10-7mol/L、10 mmol/L 、50 μ g/mL)培養(yǎng) 。

1.2.2.2 成骨特性鑒定 鈣鈷法ALP組織化學染色將誘導10 d、20 d后鋪滿細胞的蓋玻片取出,PBS沖洗,950 mL/L 酒精固定,孵育液(20 g/L β-甘油磷酸鈉、20 g/L巴比妥納、20 g/L氯化鈣和20 g/L硫酸鎂)pH 7.2,在37℃條件下孵育1 h～3 h,蒸餾水洗1次,20 g/L硝酸鈷水溶液作用2 min,蒸餾水洗1 min,10 g/L硫化銨水溶液作用1 min,流水洗后中性紅復染核。

1.2.3 成脂肪誘導

1.2.3.1 誘導方法 將融合生長的第6代MSCS消化計數(shù),以相同種植密度5×103/mL接種于24孔板中,分別進行常規(guī)培養(yǎng)和在培養(yǎng)液中加入成脂誘導劑培養(yǎng)。細胞接種在正常培養(yǎng)體系中3 d～7 d,細胞接近融合后加入包括1 μ mol/L的地塞米松 、10 μ g/mL胰島素和 50 mL/L FBS 的培養(yǎng)基 ,繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h,可重復以上步驟至出現(xiàn)脂滴。

1.2.3.2 脂肪細胞特異性染色——油紅染色100 mL/L甲醛等滲鹽溶液將細胞固定10 min,油紅染色3 min～5 min,600 g/L磷酸三乙酯洗15 s～30 s,蒸餾水沖洗15 s～30 s,蘇木素復染核1 min,自來水洗5 min,甘油明膠液封片。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的分離、擴增、培養(yǎng)與鑒定

種植2 h后細胞開始貼壁,24 h內(nèi)大部分細胞貼壁,少部分細胞懸浮于培養(yǎng)液,成團聚集(為實質(zhì)細胞)。倒置顯微鏡下,貼壁細胞呈圓形,有小的胞漿突起。72 h后,大多數(shù)細胞有胞漿突起,呈圓形、橢圓形、星形或梭形。1周后以梭形細胞為主,胞漿豐富,核大,核染色質(zhì)細,核仁明顯(圖1A)。隨傳代次數(shù)增加,懸浮細胞逐漸減少,貼壁細胞形態(tài)上逐漸趨于一致。第3、5代細胞吉姆薩染色后,光鏡下可見成纖維樣細胞形態(tài),細胞成平行排列生長或旋渦狀生長(圖 1B)。流式細胞儀檢測胰腺MSCs的CD34、CD44的表達陰性(圖2)。

圖1 胰腺間充質(zhì)干細胞形態(tài)Fig.1 Culture and iclentification of pancreas MSCS

圖2 CD34和CD44在胰腺間充質(zhì)干細胞的表達Fig.2 Expression of CD34 and CD44 in pancreas MSCs

2.2 成骨誘導

2.2.1 形態(tài)學觀察 多次傳代的MSCs達融合生長時,有更均勻有序的成纖維樣細胞分布(圖3A)。成骨誘導后細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,出現(xiàn)扁平無規(guī)則細胞堆積,光學顯微鏡下觀察可見有明顯的鈣化結(jié)節(jié)(圖3B)。這時的細胞排列有一定的方向性,呈漩渦樣生長,渦旋中心細胞呈多層分布,細胞界限不清,細胞形態(tài)呈多角形或圓形。

2.2.2 鈣鈷法ALP組織化學染色 未誘導細胞鈣鈷法ALP組織化學染色為陰性(圖3C),誘導細胞鈣鈷法ALP組織化學染色在第10天時不明顯,在第20天時可見陽性細胞胞漿中出現(xiàn)灰黑色顆粒沉淀,深淺不一,細胞密集區(qū)染色較深(圖3D)。

圖3 胰腺間充質(zhì)干細胞成骨誘導Fig.3 Pancreas MSCs were induced into bone formation cells

2.3 成脂誘導

2.3.1 形態(tài)學觀察 在成脂誘導劑中培養(yǎng)的細胞,逐漸變圓,體積較大,細胞膜較薄,膜輪廓不光滑,凹凸不平有皺褶,3 d左右在一些細胞核周圍出現(xiàn)折光性強的脂肪小滴,逐漸增多并融合成大脂肪滴,隨著時間延長,脂滴逐漸增加并融合為脂泡。細胞由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或多角形,7 d左右可見折光性強的脂肪小滴及融合的大脂肪滴出現(xiàn),大量圓形脂滴,大小不等且多散在,核仍位于邊緣,而對照組的MSCs始終為長梭形,無脂滴積聚。

2.3.2 脂肪細胞特異性染色結(jié)果 染色后脂滴為橙紅色(圖4A),脂肪細胞中含有大小不等的脂肪滴,細胞核被脂滴擠于一側(cè),給蘇木素復染,胞核為藍色(圖4B)。

圖4胰腺間充質(zhì)干細胞成脂誘導Fig.4 Pancreas MSCs were induced into fat cells

3 討論

3.1 胰腺間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

大量研究表明,任何器官與組織基質(zhì)細胞均是某一器官、組織功能細胞的支持細胞。所以,各器官與組織內(nèi)均存在具有干細胞特點的間質(zhì)細胞系[6]。胰腺組織屬于體內(nèi)較穩(wěn)定組織,呼瑩等[7]證明胎兒胰腺中存在MSCs。Rapoport D H等[8]從人胰腺分離出細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)獲得多能干細胞。本文利用常規(guī)貼壁篩選純化法成功獲得了胰腺MSCs。培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),胰腺間充質(zhì)干細胞倍增時間平均為5 d,說明其有較強的增殖能力,通過測定表面抗原CD34、CD44均表達陰性,干細胞表面抗原CD34、CD44為陰性表達[9],證明其具有干細胞特性。

3.2 誘導成骨、成脂分化特性

胰腺MSCs是多能干細胞,具有多向分化潛能,在體外培養(yǎng)條件下,加入相應的誘導因子可誘導成骨或成脂等。

體外培養(yǎng)時成骨分化很大程度上依賴于誘導條件,其中基本的輔劑為地塞米松(Dex)、β-甘油磷酸鈉(β-GP)和維生素C[10]。Dex可誘導MSCs分化表達OCN,增加OP和 ColI mRNA,提高MSCs對甲狀旁腺激素(PTH)和前列腺素 E2(PGE2)反應的cAMP水平;同時還可以調(diào)節(jié)成骨樣細胞合成胰島素樣生長因子(IGFs)和促進膠原合成的作用,刺激其ALP活性。Chung C H等[11]認為,體外成骨細胞骨化必須有β-甘油磷酸鈉的參與,β-GP提供磷離子作為ALP作用的底物,誘導和激活ALP,促進有機磷向無機磷轉(zhuǎn)化,并加速鈣鹽沉著才能形成鈣沉積。但其在懸液中的濃度不能超過2 mmol/L,否則,不能形成鈣沉積。維生素C可通過多種途徑如基因轉(zhuǎn)錄、羥基化以及前膠原形成等刺激細胞外膠原基質(zhì)的生物合成,含膠原的細胞外基質(zhì)合成是誘導成骨的必須要求。研究證實[12]維生素C可誘導BMSCs的ALP活性,促進成骨標記蛋白mRNA的表達,鈣的沉積,礦化結(jié)節(jié)的形成。ALP是成熟成骨細胞的標志性酶之一[13],它能夠水解堿性磷酸酶,使局部PO4+濃度升高,破壞鈣化抑制劑,在體外鈣化起著關(guān)鍵作用,因而也用于證明所誘導的細胞具有與成骨細胞相似的生物學特性。

骨形成過程的起始還與骨量的多少、MSCs的接種數(shù)量以及密度有關(guān)[14]。Nuttall M E等[15]報道,已表達骨鈣素OCN的成骨細胞能被100%誘導表達成脂肪細胞;肥大的軟骨細胞可以轉(zhuǎn)分化而表達成骨細胞的標志物。所以,人們推測在MSCs分化的過程中存在雙潛能細胞的階段。

本文用地塞米松,胰島素等試劑誘導3 d時MSCs有脂滴出現(xiàn),隨著誘導時間延長,細胞中的脂肪滴逐漸增加,并融合成較大的脂肪泡。脂肪細胞分化過程可分為多能干細胞-脂肪母細胞-前脂肪細胞-不成熟脂肪細胞-成熟脂肪細胞。一般認為,前脂肪細胞經(jīng)歷不成熟脂肪細胞階段后分化為成熟脂肪細胞,而不成熟脂肪細胞的特征是細胞內(nèi)含較多小脂滴[16]。從脂滴出現(xiàn)到整個細胞內(nèi)脂滴融合,這一階段相當于不成熟脂肪細胞階段[17],但在鏡下出現(xiàn)明顯脂滴之前,已分化的細胞內(nèi)透亮顆粒,從胞膜下開始出現(xiàn),沿細胞膜呈周圍性分布,此階段應為不成熟脂肪細胞的初期階段。待均勻脂滴充滿細胞后又經(jīng)歷一次更大體積的脂滴融合,成為細胞內(nèi)的脂泡。在此階段細胞形態(tài)變化較大,以后即進入終末分化階段。Patricia A等[18]研究表明,在脂肪細胞的分化調(diào)控中,核激素受體家族中PPARγ 2、轉(zhuǎn)錄因子家族成員C/EBP以及脂肪決定-分化因子1起決定作用。骨髓基質(zhì)細胞斑點印跡分子雜交研究表明,地塞米松能夠誘導骨髓基質(zhì)細胞向脂肪細胞分化。Ap2 mRNA是脂肪細胞分化晚期特異性標志物,僅在脂肪細胞分化過程中表達。成脂誘導使Ap2 mRNA表達明顯高于對照組,表明激素能夠從基因水平直接誘導骨髓基質(zhì)細胞向脂肪細胞分化;糖皮質(zhì)激素可以通過Ap2基因5′旁側(cè)區(qū)中的成分介導激活Ap2基因轉(zhuǎn)錄,這可能是地塞米松誘導骨髓基質(zhì)細胞分化成脂肪細胞的分子機制。

本文從新生大鼠胰腺中分離純化出間充質(zhì)干細胞,并在體外采用不同的誘導劑將純化細胞誘導成骨、成脂,說明胰腺中存在尚未分化的間充質(zhì)干細胞,它具有多向分化潛能,這將為胰腺相關(guān)疾病的干細胞移植治療的細胞來源提供新的思路。

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Study on Separation,Identification and Differentiation Potential of Rat Pancreas Mesenchymal Stem Cells

ZHAO Cheng-cheng1,FAN Dong-yan2,YE Hai-qing3

(1.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,J ilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China;2.Department of Health Toxicology,School of Public Health,Jilin University,Changchun,J ilin,130021,China;3.Department of Food Quality and Saf ety,School of Agriculture,J ilin University,Changchun,J ilin,130062,China)

To study the differentiation potential of MSCs that isolated from neonate rat's pancreas,and find a new source of cells for treatment of pancreas disease by stem cell transplantation,pancreases were taken out of three-day-old Wistar rats under bioclean condition,and cells were obtained by V-collagenase digestion.Generations were passed by conventional culture,cells were purified by adherence screening method,cell morphous was observed by Giemsa staining.The expressions of surface marker CD34 and CD44 were determined by FCM.The differentiation potential were evaluated by induction with ossification inducer and fat inducer.Purified MSCs were induced into bone cells by ossification inducer and were induced into fat cells by fat inducer,and it proved that purified cells are not adult somatic cells but matrix cells,and it has multi-differentiation potential.

rat;pancreas;mesenchymal stem cells;differentiation potential;induction

2010-01-20

資金項目:國家自然科學基金資助項目(39970741)

趙程程(1988-),女,吉林長春人,主要從事生物工程研究。*通訊作者

Q813.11

A

1007-5038(2010)08-0011-06