歐陽(yáng)解秀,吳小平,歐陽(yáng)珊,李紹波

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌 330031)

DNA序列在蚌科分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用*

歐陽(yáng)解秀,吳小平*,歐陽(yáng)珊,李紹波

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌 330031)

蚌科動(dòng)物是世界上瀕危的動(dòng)物類(lèi)群之一,DNA作為遺傳信息的載體,直接對(duì)DNA序列進(jìn)行分析和比較是研究蚌科分子系統(tǒng)學(xué)最理想的方法,也是研究最佳保種計(jì)劃最關(guān)鍵的資料。論文從研究方法(包括基因組DNA的提取、目的基因的選擇、PCR引物和擴(kuò)增條件的選用)和各亞科分子系統(tǒng)學(xué)的研究結(jié)果等方面,總結(jié)了蚌科分子系統(tǒng)學(xué)的研究進(jìn)展,并展望了中國(guó)蚌科分子系統(tǒng)學(xué)的研究方向。

DNA序列;蚌科;分子系統(tǒng)學(xué)

蚌科動(dòng)物是淡水底棲動(dòng)物的重要類(lèi)群,由于其生態(tài)學(xué)意義、經(jīng)濟(jì)上的重要性、資源豐富、復(fù)雜的生活史和最近數(shù)量上的急劇下降,已經(jīng)引起了很多研究者的關(guān)注[1]。蚌科動(dòng)物是淡水貝類(lèi)最大的一個(gè)科,包括674個(gè)物種[2-3]。由于蚌科動(dòng)物存在趨同現(xiàn)象,且目前大多數(shù)種和屬的分類(lèi)都是以歷史上形態(tài)特征為依據(jù),種和屬的分類(lèi)都是在18世紀(jì)末和19世紀(jì)初定義的,使得蚌類(lèi)保護(hù)工作的困難就在于對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確的分類(lèi)[4]。隨著研究的深入,以形態(tài)特征為基準(zhǔn)的系統(tǒng)發(fā)育分析常常遇到困難,近代生物化學(xué)和分子生物技術(shù)的發(fā)展,特別是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,孕育了分子系統(tǒng)學(xué),DNA序列分析為生物系統(tǒng)學(xué)的研究提供了分子水平上的證據(jù)。以分子數(shù)據(jù)來(lái)描述蚌科各個(gè)類(lèi)群之間關(guān)系的研究,已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視和興趣[5-6]。本文對(duì)近年來(lái)DNA序列在蚌科分子系統(tǒng)學(xué)方面的研究進(jìn)行較為系統(tǒng)的總結(jié),以期為后來(lái)的研究者提供一定的借鑒。

1 研究方法

1.1 蚌科基因組DNA提取法

高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行分子系統(tǒng)研究的基礎(chǔ),苯酚法和CTAB法是提取蚌基因組DNA常用的兩種方法(950 mL/L乙醇中的浸泡標(biāo)本提取基因組DNA)。

1.1.1 苯酚法 取0.1 g閉殼肌或外套膜用ddH2O洗凈,加液氮碾碎→轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管加入 500 μ L組織勻漿緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;50 mmol/L EDTA,pH 8.0)→混勻后加入200 μ L 100 g/L 的SDS 和 5 μ L 的蛋白酶K,50℃～55℃裂解 6 h→加入等體積苯酚,5 000 r/min離心5 min→取上清轉(zhuǎn)移至一新離心管加3 μ L RNaseA,37℃水浴1 h→加入等體積苯酚,5 000 r/min離心5 min→取上清,移至一新離心管加入等體積苯酚,5 000 r/min離心5 min→取上清加1/10體積的NaAc 3 μ L和2倍體積的無(wú)水乙醇,混勻,于-20℃沉淀30 min→10 000 r/min離心10 min,去液體 →加入 750 mL/L乙醇洗滌,6 000 r/min離心5 min,去液體→干燥2 h～3 h→再加入50 μ L TE,使DNA 充分溶解-20 ℃保存[7]。

1.1.2 CTAB法 取0.1 g閉殼肌放于消毒過(guò)的玻片上,用小刀將組織切碎,轉(zhuǎn)移至2 mL的預(yù)冷離心管中→加入 600 μ L CTAB提取液,混勻→65℃中水浴3 h,水浴期間每隔30 min將離心管顛倒混勻→加入等體積苯酚,參照苯酚法抽提→取上清用預(yù)冷的異丙醇-20℃沉淀3 h→10 000 r/min離心10 min,去液體→加入75%乙醇洗滌,6 000 r/min離心5 min,去液體→干燥2 h～3 h→再加入 50 μ L TE,使DNA充分溶解,置-20℃保存[8]。

苯酚法提取的DNA純度高、電泳條帶完整、清晰,所得DNA質(zhì)量有可能優(yōu)于CTAB法,但其提取過(guò)程較為復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高。CTAB法所提取的DNA能適用于一般分子生物學(xué)研究,且該方法在實(shí)驗(yàn)操作中不用液氮碾磨,耗時(shí)短、降低了成本。對(duì)于分子系統(tǒng)學(xué)研究來(lái)說(shuō),兩種方法都是可行的。

1.2 目的基因、研究類(lèi)群、PCR引物的選擇及其擴(kuò)增條件

1.2.1 目的基因、PCR引物的選擇 不同目的基因,所選用的引物不同,蚌科動(dòng)物分子系統(tǒng)發(fā)育研究選用的目的基因引物序列都比較多,詳見(jiàn)表1。

1.2.2 不同基因片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

(1)擴(kuò)增16 S rRNA片段所用引物為16 S 3L和 16 S 4H(表 1)。

94℃,2 min→35個(gè)循環(huán)(94℃,1 min→57℃,30s→72℃,1 min)→72℃延伸8 min[5]。

(2)COI片段擴(kuò)增用引物為COI-22me和COI-700dy(表1)。

94℃,2 min→35個(gè)循環(huán)(94℃,30 s→42℃,30 s→72℃,1.5 min)→72℃延伸3 min[9]。

(3)ND1片段擴(kuò)增用引物為L(zhǎng)eu-uurF和NIJ-12073(表1)。

94℃,2 min→34個(gè)循環(huán)(94℃～98℃,40 s→50℃～58℃,1 min→68-72℃,1.5 min)→72℃延伸3 min[10]。

(4)Cytb片段擴(kuò)增用引物為Cytb-F和Cytb-R(見(jiàn)表1)。

94℃,2 min→40個(gè)循環(huán)(94℃,1 min→50℃,1 min→72℃,2 min)→72℃延伸3 min[11]。

(5)ITS1片段擴(kuò)增用引物為18 S和5.8 S(見(jiàn)表1)。

95℃,5 min→30個(gè) 循環(huán)(95℃,30s→48℃～55℃,1 min→72℃,1 min)→72℃延伸3 min[12]。

(6)ITS2片段擴(kuò)增用引物為ITS2-F和ITS2-R(見(jiàn)表1)。

95℃,5 min→30個(gè)循環(huán)(95℃,30s→48℃～55℃,30 s～60 s→72℃,1 min)→72℃延伸3 min[13]。

表1 蚌科動(dòng)物擴(kuò)增不同DNA片段/基因所用引物序列Table 1 Primers of different DNA/gene in Unionidae for PCR

2 主要研究結(jié)果

Graf Daniel L等[2]將蚌科分為兩個(gè)亞科,即Unioninae和 Ambleminae,其中 Unioninae包括Unionini和Anodontini兩大類(lèi)群,Ambleminae包括 Amblemini、Quadrulini、Pleurobemini、和 Lampsilini共四大類(lèi)群。

而根據(jù) NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=47526&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)的分類(lèi)信息來(lái)看,全世界所有蚌科動(dòng)物可 分 為 Unioninae、Anodontinae、Ambleminae、Lampsilinae 4個(gè)亞科。我國(guó)的蚌科動(dòng)物主要屬于Unioninae和Anodontinae,有部分種類(lèi)可歸為Ambleminae[2],Lampsilinae大多分布在為北美地區(qū)(參考:http://www.inhs.uiuc.edu/%7eksc/Mussel-Genera.html)。

2.1 Unioninae(珠蚌亞科)的系統(tǒng)發(fā)育研究

Unioninae珠蚌亞科蚌類(lèi)包括Acuticosta(尖嵴蚌屬)、Arconaia(扭蚌屬)、Cuneopsis(楔蚌屬)、Hyriopsis(帆蚌屬)、Lanceolaria(矛蚌屬)、Schistodesmus(裂脊蚌屬)、Solenaia(蟶蚌屬)、Unio(珠蚌屬)、Ptychorhynchus(尖鋤蚌屬)、Inversidens、Villosa共 11個(gè)屬。除Inversidens分布在日本,Villosa分布在北美,其他9個(gè)屬均為我國(guó)特有蚌類(lèi)[2]。

Huang Y Y等[5]以線粒體16S rRNA部分序列為基礎(chǔ),以貽貝為外類(lèi)群,結(jié)果表明:帆蚌屬、蟶蚌屬、尖鋤蚌屬應(yīng)歸為小方蚌亞科。魏開(kāi)建[12]以IST1部分序列為基礎(chǔ),長(zhǎng)耳珠母貝(Pinctada chemnitzi)和合浦珠母貝(Pinctada martensi)2個(gè)種類(lèi)為外類(lèi)群,結(jié)果表明,我國(guó)珠蚌亞科的扭蚌、劍狀矛蚌、短褶矛蚌、圓頭楔蚌、絹絲麗蚌、圓頂珠蚌、中國(guó)尖峭蚌聚為一支,置信度為100%。周春花等根據(jù)16 S rRNA基因和ND1基因的部分核苷酸序列構(gòu)建了中國(guó)蚌科麗蚌屬的分子系統(tǒng)發(fā)育,并建立中國(guó)蚌科的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示:麗蚌屬形成兩個(gè)明顯的類(lèi)群,構(gòu)成尖麗蚌屬和麗蚌屬。尖麗蚌屬屬于珠蚌亞科,麗蚌屬屬于緩行蚌亞科(小方蚌亞科)[14]。

2.2 無(wú)齒蚌亞科的系統(tǒng)發(fā)育研究

Anodontinae(無(wú)齒蚌亞科)包括Anodonta(無(wú)齒蚌屬)、Cristaria(冠蚌屬)、Lepidodesma(鱗皮蚌屬)、Alasmidonta(Say,1818-North America)、Anodontoides(Simpson,1898-North America)、Gonidea(Conrad, 1857-North America)、Lasmigona(Rafinesque,1931-North America)、Pilsbryoconcha(Simpson 1900-Southeast Asia)、Pseudanodonta(Simpson, 1900-Europe)、Pyganodon(Crosse&Fischer,1894-North America)、Strophitus(Rafinesque,1820-North America)、Utterbackia(Baker 1928-North America)13 個(gè)屬。

Mock K E等[15]以COI序列為基礎(chǔ),對(duì)Bonneville Basin流域和北美西部其他幾個(gè)流域的Anodonta(無(wú)齒蚌屬)群體進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,Bonneville Basin流域的無(wú)齒蚌屬群體與相鄰Nevada的Lahontan Basin關(guān)系較近,但總的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)差異較小,因此,影響無(wú)齒蚌的數(shù)量減少的因素需要對(duì)人為因素進(jìn)行更多的探討,同時(shí)要更深的綜合分析北美西部無(wú)齒蚌的遺傳與形態(tài)變異。

Chong Jer Pin等[16]以COI序列為基礎(chǔ)分析了北美西部無(wú)齒蚌屬群體相互關(guān)系,表明了存在著3個(gè)差異明顯 的 類(lèi) 群,即A.californiensis/nuttalliana、A.oregonensis/kennerlyi和A.beringiana,A.californiensis和A.oregonensis距離較遠(yuǎn),而A.b eringiana和亞洲的A.woodiana關(guān)系則比其他兩個(gè)類(lèi)群都要近。King Tim L等[17]以COI和ITS1序列為基礎(chǔ)分析了Lasmigona subviridis種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,表明Susquehanna和Potomac Rivers很多南部群體存在種內(nèi)遺傳分離,不同河流之間基因流動(dòng)少,南北群體生殖隔離,在保種時(shí)應(yīng)該作為兩個(gè)不同的單元進(jìn)行保種,也許Lasmigona屬的4個(gè)代表種還可以進(jìn)一步分類(lèi)。

2.3 Ambleminae(小方蚌亞科)的系統(tǒng)發(fā)育研究

Ambleminae(小方蚌亞科)包括Lamprotula(Simpson,1900-Asia,麗蚌屬)、Cyprogenia(Agassiz,1852-North America,膨蚌屬)、Dromus(Simpson,1900-North America,走蚌屬)、Fusconaia(Simpson,1900-North America,楔狀水蚌屬)、Plethobasus(Simpson,1900-North America,豐底蚌屬)、Pleurobema(Frierson,1927-North America,側(cè)底蚌屬)、Quadrula(Rafinesque,1820-North America,方蚌屬)、Amblema(Rafinesque,1820-North America)、Caelatura(Egypt)、Ellipsaria(Rafinesque,1820-North America)、Elliptio(Rafinesque,1819-North America)、Elliptoideus(Frierson,1927-North America)、Hemistena(Rafinesque,1820-North America)、Lexingtonia(Ortmann,1914-North America)、Megalonaias(Utterback,1915-North America)、Plectomerus(Conrad,1853-North America)、Potamida(Swainson,1840-European)、Pseudodon(Gould 1844-Singapore)、Quincuncina(Ortmann,1922-North A-merica)、Tritogonia(Agassiz,1852-North America)、Uniomerus(Conrad,1853-North America)共21個(gè)屬。

Elderkin C L等[9]以COI序列為基礎(chǔ)分析了Ambelma plicata的群體遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,從北到南群體內(nèi)的遺傳變異不斷增大,Strawberry河流和Lake Erie流域群體的遺傳變異較低Lake Erie流域和Ohio河流有著相似的遺傳結(jié)構(gòu),對(duì)Ambelma plicata來(lái)說(shuō)保護(hù)物種的多樣性要注重群體各個(gè)體的數(shù)量。

Sleem Setaita H等[18]用分子標(biāo)記RAPD技術(shù)研究表明Caelatura屬Nile河的兩個(gè)有疑問(wèn)種C.companyoi和C.prasidens按遺傳距離的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)也是完全兩個(gè)不一樣的物種。

Elderkin C L等[19]以COI序列為基礎(chǔ),分析了北美 Lake Erie和Ohio River水域,沿著Ouachita和Strawberry河的東南方Elliptio dilatata的種群結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,種群內(nèi)遺傳分化明顯,不同水域差異明顯,由北到南,種群內(nèi)變異不斷增加,Strawberry河的遺傳分化較低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)在Ouachita河的種群有著明顯的生殖隔離現(xiàn)象,北部的基因流動(dòng)較少。

Serb Jeanne M 等[10]以ND1序列為基礎(chǔ),分析了北美 Quadrula屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)果表明Quadrula可分為3大類(lèi)群,即Quadrula,Metanvera和Pustulosa,與以往的分類(lèi)不同的是pustulosaquadrula類(lèi)群還包含 Fusconaia和 Quincuncina屬,Quadrula還包括T ritogonia屬。

Grobler Paul J等[20]以ND1和IST1序列為基礎(chǔ),分析了美國(guó)東南部 Tennessee River水域Dola-belloides分類(lèi)情況,結(jié)果表明該區(qū)域各流域的類(lèi)群距離差異小,按分子信息的標(biāo)準(zhǔn)屬于一類(lèi),但在Tennessee Rive水域可以劃為兩個(gè)管理單元。

Burdick Ryan C等[21]以COI序列為基礎(chǔ),分析了Mississippi River,加拿大,Great Lakes和Gulf Coast水域Fusconaia f lava的系統(tǒng)發(fā)育情況,表明改物種可以分為兩大類(lèi),即F.f lava和F.cerina,而不是通常認(rèn)為的單個(gè)類(lèi)群,但兩大類(lèi)群的關(guān)系需要結(jié)合遺傳和形態(tài)特征進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.4 亞科的系統(tǒng)發(fā)育研究

Lampsilinae亞科包括Actinonaias(Crosse&Fischer,1886-North America)、Cyrtonaias(Crosse&Fischer,1894-Central America)、Epioblasma(Simpson,1900-North America)、Glebula(Conrad,1853-North America)、Hamiota(Roe and Hartfield(2005)-North America)、Lamellidens(Simpson, 1900-Asia-India)、Lampsilis(Rafinesque, 1820-North America)、Leptodea(Rafinesque,1920-North America)、Medionidus(Simpson,1900-North America)、Obliquaria(Rafinesque,1820-North America)、Obovaria(Conrad, 1853-North America)、Potamilus(Rafinesque, 1818-North America )、Ptychobranchus(Simpson,1900-North America)、Toxolasma(Rafinesque,1831-North America)、Truncilla(Rafinesque,1820-NorthAmerica)、Paraleptodea共 16個(gè)屬,除Lamellidens(Simpson,1900-Asia-India)、Paraleptodea外其他14個(gè)屬都分布在北美。

Zanatta David T等[22]用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)和以COI序列為基礎(chǔ),分析了北美流域Epioblasma triquetra的系統(tǒng)地理學(xué)和群體遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,Clinch和St Francis河流的mtDNA差異顯著,微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)果也表明,群體之間差異顯著,并有著明顯的遺傳結(jié)構(gòu),這表明Epioblasma triquetra群體可分為3大地理類(lèi)群,即Tennessee River,Ozark Crest河南部和與Mississippi相鄰的Ohio River的下游。Zanatta David T等[23]用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究表明,加拿大Ontario流域Lampsilis f asciola群體不是隨機(jī)交配的,而有著顯著的群體遺傳結(jié)構(gòu),且基因流動(dòng)明顯。

3 中國(guó)蚌科分子系統(tǒng)學(xué)研究現(xiàn)狀和展望

我國(guó)蚌科有一百多種,是蚌科物種多樣性豐富的地區(qū)之一[24]。近年來(lái)隨著湖泊、河流等內(nèi)陸水域污染程度加劇、對(duì)蚌科棲息地的人為干預(yù)和資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)利用,在一定程度上對(duì)蚌類(lèi)的種質(zhì)資源造成破壞,一些經(jīng)濟(jì)蚌類(lèi)的自然資源日益減少甚至瀕臨滅絕。目前中國(guó)的分類(lèi)體系是基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)[25],分子上的證據(jù)還很匱乏。通過(guò)DNA序列變化的研究,來(lái)探討中國(guó)蚌科的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題,可為進(jìn)一步研究中國(guó)淡水貝類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育研究提供遺傳物質(zhì)本身——DNA依據(jù)。結(jié)合形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)各方面的特征,將是我國(guó)蚌科分子系統(tǒng)學(xué)未來(lái)發(fā)展的主要研究手段。

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Application of DNA Sequences in Phylogenetic Study of Unionidae

OUYANG Jie-xiu,WU Xiao-ping,OUYANG Shan,LI Shao-bo

(College of Li fe Sciences and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang,J iangxi,330031,China)

Unionids are among the most imperiled organisms in the world.DNA is the carrier of genetic information,and sequencing and comparison of DNA are the ideal methods for unionidae molecular phylogenesis,is and the the most critical informations for making conservation plan.From two aspcets of methods and results,the paper summarized the advances in molecular systematics of unionidae.The methods including DNA extraction,gene sampling,primers choosing,gene amplification conditions.The paper also pointed out the status and prospects in molecular systematics research for unionidae in China.

DNA sequence;Unionidae;molecular phylogeny

Q789

A

1007-5038(2010)08-0069-05

2010-01-20

資金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30860045)資助

歐陽(yáng)解秀(1978-),女,湖南邵陽(yáng)人,博士研究生,主要從事蚌類(lèi)分子系統(tǒng)學(xué)研究。*通訊作者