王志琴,陳靜波,董 紅,張國庭,孫金權

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學院畜牧科學研究所,新疆烏魯木齊 830000)

馬垂體促性腺激素的提取及其生物活性測定*

王志琴1,陳靜波2*,董 紅2,張國庭2,孫金權1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學院畜牧科學研究所,新疆烏魯木齊 830000)

家畜胚胎移植技術在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應用日益廣泛,由于馬促性腺激素在國內外無商品出售,使馬的胚胎移植超數(shù)排卵研究和應用受到限制。本試驗用馬腦垂體提取促性腺激素,將從屠宰場采集的新鮮馬腦垂體冷凍保存,經(jīng)固定、去膜、浸泡、搗碎、勻漿、振搖提取、離心、沉淀、洗滌、脫水、干燥等步驟,得到促性腺激素提取物干粉,用小鼠做生物活性測定。結果表明,建立的馬腦垂體促性腺激素提取方法可行,提取物具有生物活性。

垂體;提取物;促性腺激素;馬

家畜胚胎移植技術在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應用日益廣泛,馬的胚胎移植可挖掘優(yōu)秀母馬品種和個體的繁殖潛力。試驗證明,母馬卵巢對其他種屬來源的促性腺激素不敏感,僅對馬屬動物來源的促性腺激素有反應。由于馬促性腺激素在國內外無商品出售,使馬的胚胎移植超數(shù)排卵研究和應用受到限制。提取馬垂體促性腺激素成為生產(chǎn)和科研中的緊迫任務。

馬的垂體位于腦的基底部,蝶骨體的腦垂體窩內[1]。腦垂體分為腺垂體(前葉)和神經(jīng)垂體(后葉)兩部分,腺垂體分泌7種激素,其中維持性腺機能的兩種激素是促卵泡素(follicle-stimulationg hormone,FSH)和促黃體素(luteinizing hormone,LH),兩者合稱為垂體促性腺激素(gonadotrophic hormone,GTH)。它們可促進睪丸的精子形成、卵泡成熟及參與黃體的形成,是垂體前葉產(chǎn)生的糖蛋白激素[2]。FSH能促進卵泡的早期發(fā)育,卵泡成熟是FSH和LH協(xié)同作用的結果。FSH促進顆粒細胞的增殖,多個卵泡生長。FSH與少量LH協(xié)同作用促進卵泡合成和分泌雌激素。FSH促進卵泡生長和成熟,使顆粒細胞上的LH受體增加,標志著卵泡已成熟。成熟卵泡在FSH和LH的作用下發(fā)生排卵[3]。

目前從豬腦垂體提取的FSH和LH已在牛、羊繁殖中廣泛應用,主要用于提早家畜的性成熟,誘導母畜發(fā)情,超數(shù)排卵處理,治療母畜繁殖疾病和提高公畜的精液品質[1]。然而,馬腦垂體激素提取與應用在國內未見報道,而且馬對豬源FSH不敏感。馬胚胎移植的超數(shù)排卵技術的推廣應用,需要用促性腺激素處理供體馬。為了開展馬胚胎移植科研工作,本試驗采集馬腦垂體,用生物化學方法提取促性腺激素,并用小鼠測定其生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 馬垂體采集 在冬季12月份～1月份,馬屠宰后,立即采集垂體,置-20℃冷凍保存,共采集3 526匹馬的垂體。

1.1.2 實驗動物 18日齡同批、同源雌性(昆明系)小鼠,體重9 g～13 g,購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3 試劑與儀器設備 100 g/L乙酸銨、乙酸、950 mL/L乙醇、乙醚和丙酮,均為國產(chǎn)分析純試劑;人絨毛膜促性腺激素,寧波激素廠生產(chǎn)。J-25 AVANPI低溫離心機(BECKMAN COULTEB),PL203電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司),DS-1組織搗碎機(上海標本模型廠),FE20 pH計(梅特勒-托利多儀器公司),SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司),LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 垂體預處理 ①固定:將冷凍保存的垂體解凍后,在室溫條件下,連腦膜一起放入適量的無水丙酮中,以固定組織、脫水和脫脂;②剝離腦膜:手工剝離垂體外周腦膜,剝離后的垂體浸入適量新鮮無水丙酮中,共更換3次丙酮,垂體經(jīng)3次丙酮浸泡后,脫水和脫脂基本完成,從丙酮浸泡液中濾出垂體放入真空干燥器中干燥[4],稱重;③分離:干燥后的垂體,分離垂體前葉和后葉,保留垂體前葉備用。

1.2.2 馬促性腺激素的提取方法和步驟 用乙醇法提取馬垂體促性腺激素。具體步驟如下:①浸泡:取垂體前葉顆粒用提取液充分溶脹;②搗碎勻漿:用組織搗碎機充分搗碎勻漿,轉入錐形瓶中;③振搖:于錐形瓶腦垂體勻漿中加入提取液,在恒溫振蕩器振搖;④離心:4℃條件下離心40 min收集上清液,沉淀加提取液,再次搗碎組織勻漿,振搖,離心得上清液,合并兩次的上清液;⑤沉淀:將上清液在攪拌下慢慢加入950 mL/L乙醇至乙醇濃度為76 mL/L～80 mL/L;放入4℃冰箱,24 h后取出,收集白色沉淀物;⑥洗滌脫水:沉淀物用離心法分別加入無水乙醇、乙醚洗滌脫水;⑦干燥:沉淀物連同離心管一起,放入真空干燥器中干燥,得到白色垂體粗提物干粉。⑧分裝:無菌分裝于滅菌小瓶中,冷凍保存,使用時用生理鹽水溶解即可。

1.2.3 馬垂體促性腺激素提取物生物活性測定①試驗分組。取同一來源的18日齡的雌性昆明小鼠,體重9 g～13 g,隨機分成 4組,每組6只。第1組為hCG組,取hCG 25 U加1 mL生理鹽水溶解;第2組為垂體提取物組,取1 mg垂體提取物溶于1 mL生理鹽水中(1 mg/mL);第3組為提取物和hCG組,取垂體提取物1 mg,加1 mL含25 mg hCG的生理鹽水溶解;第4組為溶劑對照組;②注射方法。每日上午10:00時,分別自小鼠頸部皮下注射各組的試驗藥品溶液0.2 mL,每天1次,連續(xù)注射3 d。③測定。最后1次注射后24 h,將小鼠頸椎脫臼處死,解剖。取出子宮和卵巢,剝離脂肪和周圍組織,在濾紙上吸干后,稱取濕重,并計算子宮和卵巢的平均重量。

2 結果

2.1 馬垂體促性腺激素提取結果

從馬腦垂體中提取獲得促性腺激素粗品見表1。將3 526個馬腦垂體分4批進行提取,真空干燥后,共得到腦垂體提取物19.039 g,按0.1 g/瓶和0.2 g/瓶分裝于滅菌小瓶中,儲存于-20℃冰箱。

表1 馬腦垂體促性腺激素提取結果Table 1 The results of equine pituitary GTH extraction

2.2 提取物生物活性測定結果

各組小鼠子宮平均濕重為hCG組0.080 3 g,提取物組0.099 19 g;提取物+hCG組 0.073 9 g,對照組0.043 5 g。溶劑試驗組子宮平均重量比空白組高近1倍。

各組小鼠卵巢平均濕重見表 2。hCG組0.022 g;提取物組 0.026 5 g;提取物 +hCG組0.023 3 g;對照組0.017 1 g。試驗組小鼠卵巢平均重量明顯比對照組高。

各組小鼠卵巢解剖學變化情況,hCG組和溶劑對照組小鼠的卵巢均呈現(xiàn)白色,沒有明顯變化;單純提取物組小鼠卵巢均發(fā)紅色(有卵泡發(fā)育);提取物+hCG組小鼠的卵巢顏色都出現(xiàn)紅色的變化,同時有2只鼠的卵巢上有紅色排卵點。卵巢重與子宮重與溶劑對照組比較略有增加。

表2 馬腦垂體提取生物活性測定結果Table 2 The results of bioactivity measurement of pituitary G TH extract

3 討論

3.1 馬垂體促性腺激素提取條件與要求

本提取試驗采用提取液浸泡溶脹垂體前葉,用組織搗碎機將溶脹后垂體前葉搗碎勻漿,更有利于充分振搖提取,比采用粉碎過篩方法更方便。為避免常溫下影響馬垂體提取物中促性腺激素的生物活性,所有提取過程盡可能在低溫條件下操作,以保持提取物中促性腺激素的生物活性[5]。

3.2 提取中乙醇的作用與要求

腦垂體促性腺激素屬糖蛋白激素,經(jīng)提取處理,用760 mL/L～800 mL/L乙醇作為沉淀劑使糖蛋白激素沉淀[5]。加入乙醇受溫度的影響,用-10℃～-15℃乙醇邊加邊攪拌,用酒精比重計測量乙醇濃度,可見到白色沉淀,靜置24 h～48 h,分離出沉淀物,上清液含乙醇,可回收利用[6]。

3.3 FSH和LH協(xié)同作用的關系

FSH能促進卵泡的早期發(fā)育,卵泡成熟則是FS H和LH協(xié)同作用的結果。FSH促進顆粒細胞的增殖,卵泡生長和成熟,成熟卵泡在FSH和 LH協(xié)同作用下發(fā)生排卵[7]。有研究表明,高純度的FSH制劑能引起動物卵泡生長,但不引起排卵。當血液中FSH和LH達到一定濃度且成一定比例時,才引起排卵。垂體中FSH和LH的含量和比例,因畜種不同而異,并與發(fā)情活動有密切關系[8]。因此,本試驗提取物為FSH和LH的混合物,且比例是馬垂體的自然比例,促馬卵泡發(fā)育最為合適,不需要進行分離即可使用。

3.4 馬垂體提取物生物活性測定效果判斷

本試驗用小鼠測定馬腦垂體提取物的生物活性,結果表明從馬腦垂體中提取出的提取物含有促性腺激素,能對小鼠卵巢和子宮產(chǎn)生作用,使小鼠的卵巢顏色出現(xiàn)紅色的變化(有卵泡發(fā)育),卵巢表面有紅色排卵點,與對照組有明顯區(qū)別,可以確定馬腦垂體提取激素具有生物活性。隨后在母馬使用的結果也證明了本試驗提取物具有較高的生物活性,本試驗的垂體提取方法可行。

綜上所述,本試驗用馬腦垂體提取獲得的促性腺激素提取物,用小鼠做生物活性測定,結果表明本試驗提取的馬垂體促性腺激素提取物具有生物活性。

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Extraction and Bioactivity Measurement of Equine Pituitary GTH

WANG Zhi-qin1,CHEN Jing-bo2,DONG Hong2,ZHANG Guo-ting2,SUN Jin-quan1

(1.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi,Xinjiang,830052,China;2.Institute of Animal Science,Xinj iang Academy of Animal Science,Urumqi,Xinj iang,830000,China)

The equine embryo transfer can greatly increase the number of offspring for desire mare individuals.But its application is restricted by the effective of GTH method and the regents for the superovulation treatment.T he equine GTH(gonadotrophic hormone)is only one or a few hormones which effective for the mare superovulation stimulation.The objectives of present experiment were to obtain the extract of horse pituitary and measure its bioactivity.The 3526 horse pituitaries were taken from slaughterhouse freshly,freezing immediately under-20℃.The pituitary GT H crude powder were obtained by fixing,separating the brain membrane,immersion,ground and oscillation centrifugation,sedation,washing,dehydration and dry.The bioactivity was measured by using the mice.The results proved that GTH extraction was successful established.

pituitary;extract;gonadtrophic hormone;equine

Q575.12

A

1007-5038(2010)08-0017-04

2010-04-21

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳科技攻關項目(200741118)

王志琴(1957-),女,陜西西安人,副教授,主要從事畜產(chǎn)品檢驗檢疫教學與科研工作。*通訊作者