蓋春云 ,張 燦,單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266109)

干擾素是在特定的誘生劑作用下,由淋巴細(xì)胞分泌的具有抗病毒、影響細(xì)胞生長分化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能等活性的糖蛋白[1]。但在動(dòng)物體內(nèi)自身存在的干擾素極其微量,以傳統(tǒng)的方法難以制備和純化,因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組干擾素是解決這一難題的有效途徑。國內(nèi)外已經(jīng)對(duì)鴨、豬甚至大熊貓等許多動(dòng)物的干擾素的抗病毒活性進(jìn)行了研究,均產(chǎn)生了良好的效果[2-4]。而對(duì)于水貂α干擾素的研究現(xiàn)在做的人很少,只有人在GenBank上發(fā)表了α干擾素的基因序列,對(duì)于其蛋白質(zhì)的表達(dá)及生物學(xué)作用的研究探討現(xiàn)在還沒有相關(guān)文章的報(bào)道。

在我國干擾素研究起步較晚,而我國水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展迅速,而對(duì)于水貂等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的疫病防控措施又很少。因此通過本試驗(yàn)水貂干擾素的重組質(zhì)粒的構(gòu)建,并在大腸桿菌中進(jìn)行有效表達(dá),為進(jìn)一步探討表達(dá)產(chǎn)物的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),可對(duì)于水貂一些疾病如水貂犬瘟熱、水貂細(xì)小病毒性腸炎、水貂阿留申病等水貂病毒性疾病的預(yù)防與治療有重要作用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 pMD-18T購自 TaKaRa公司,E.coli BL21及pET32a表達(dá)質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 酶和試劑 EcoR I、XholⅠ限制性內(nèi)切酶及附帶的10×Buffer,dNTP,Taq DNA聚合酶 ,均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。T4 DNA連接酶,質(zhì)粒DNA快速提取試劑盒,DNA凝膠回收試劑盒,購自北京賽百盛公司。

1.3 水貂基因組的提取 參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”提取基因組DNA[5]。

1.4 基因克隆及其質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank上報(bào)道的水貂IFN-α序列設(shè)計(jì)引物,以提取的總基因組為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系25μ L,62℃退火,32個(gè)循環(huán)。引物如下:

上游:5′-ATGGCCCTGCCCTGCTCCT-3′;下游 :5′-TCACTTCCTGCTCCGCAATCTC-3′將擴(kuò)增的目的條帶與pMD-18T連接,構(gòu)建質(zhì)粒pMD-18T/IFN-α,PCR鑒定后,送T aKaRa公司測序。采用DNAMAN軟件及在線軟件進(jìn)行序列分析。根據(jù)測序結(jié)果,以pMD-18T/IFN-α為模板,擴(kuò)增水貂 IFN-α成熟肽,反應(yīng)體系 25 μ L,退火62℃,32個(gè)循環(huán)。引物如下:

上游 :5′-GCC GAA T TC CT T GT T TGT GGC CCT GGT G-3′含 EcoRⅠ酶切位點(diǎn) ,下游:5′-GCA CTC GAG TCA CTT CCT GCT CCG CAA TCT-3′含 XholⅠ酶切位點(diǎn)。

對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收,連接到pET32a載體上,構(gòu)建質(zhì)粒pET32a/IFN-α,進(jìn)行PCR鑒定以及雙酶切鑒定。

1.5 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化取陽性菌株接種于含氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min振搖培養(yǎng)待其生長至 A600為1.0左右,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,誘導(dǎo)6 h,分別取上清及沉淀,進(jìn)行 SDS-PAGE電泳及Western blot分析。

1.6 少量目的蛋白的純化回收 運(yùn)用KCL染色方法對(duì)蛋白進(jìn)行少量回收[6]。

1.7 活性測定 本試驗(yàn)通過細(xì)胞病變抑制法測定干擾素的抗病毒活性。以能抑制 50%細(xì)胞病變的干擾素最高稀釋度作為 1個(gè)單位。根據(jù)待測樣品不同稀釋度的保護(hù)能力,計(jì)算出干擾素生物學(xué)活性單位。將已稀釋的蛋白,取20 μ L進(jìn)行梯度稀釋分別于 20 μ L鴨腸炎病毒(COV)進(jìn)行混合,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板生長良好的24 h雞胚成纖維(MDCK)細(xì)胞,同時(shí)設(shè)鴨腸炎病毒陽性對(duì)照(以PBS取代IFN-α)以及空白對(duì)照,72 h后觀察細(xì)胞病變[7]。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α基因的克隆及序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖1所示。在約564 bp處有一條特異性目的條帶,大小與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果與GenBank有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的IFN-α的核苷酸序列進(jìn)行比較,其同源性為98%。通過用在線軟件SOPMA及Signal P3.0server對(duì)IFN-α基因氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,N末端的18個(gè)疏水氨基酸為信號(hào)肽,成熟多肽為163個(gè)氨基酸,成熟多肽中有6個(gè)半胱氨酸殘基;a螺旋的比例為62.03%。

圖1 IFN-αPCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 IFN-α成熟肽基因擴(kuò)增及表達(dá)載體的鑒定構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)雙酶切以及PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。酶切圖譜與預(yù)期結(jié)果相同,在約543 bp處有一條特異條帶。表明已成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET 32 a/IFN-α。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 SDS-PAGE電泳 篩選鑒定的陽性工程菌進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)進(jìn)行BL21空菌體誘導(dǎo)對(duì)照,誘導(dǎo)6 h離心后,分別取上清和沉淀各15 μ L,經(jīng)SDSPAGE分析顯示,分子量約為36 ku,Western blot結(jié)果顯示,在約36 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)。菌體上清中可獲得高效表達(dá),經(jīng)BandScan 5.0軟件分析,其表達(dá)量約占整個(gè)菌體的50%。

2.4 活性測定結(jié)果 倍比稀釋的水貂 IFN-α與CDV混合后,分別接種于MDCK細(xì)胞,72 h后觀察稀釋到空白對(duì)照組顯示正常,而陽性毒組出現(xiàn)明顯病變。算得其標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)約為1.6×104U·mL-1,其比活性為1.1×105U·mg-1。

圖3 pET32a/IFN-α重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析及 Western blot檢測

3 討論

干擾素(IFN)系統(tǒng)是目前所知的發(fā)揮作用最快的第一病毒防御體系,可在很短時(shí)間(幾分鐘內(nèi))使動(dòng)物機(jī)體處于抗病毒狀態(tài),使動(dòng)物機(jī)體在1～3周內(nèi)對(duì)病毒重復(fù)感染有抵抗作用[8]。

國內(nèi)外僅對(duì)水貂IFN-α的基因序列做過報(bào)道,本試驗(yàn)對(duì)水貂IFN-α蛋白的表達(dá)及活性測定,可以進(jìn)一步提高對(duì)水貂干擾素的生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí),為其發(fā)揮對(duì)某些經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的病毒性疾病的預(yù)防及治療等臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

在對(duì)其他物種的干擾素的研究中,已有發(fā)現(xiàn)其種族特異相對(duì)比較強(qiáng)但其誘導(dǎo)的抗病毒活性在不同物種間存在一定相互交叉現(xiàn)象[9],其抗病毒效果具有非特異性。本試驗(yàn)水貂IFN-α在雞胚成纖維細(xì)胞可以對(duì)鴨瘟病毒產(chǎn)生抗病毒活性,但效果比雞的干擾素的較差,主要可能是水貂與雞的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)造成的。另外利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)真核生物基因表達(dá)存在著一定的弊端,不能實(shí)現(xiàn)在真核生物中翻譯后加工、修飾等也是重組IFN-α活力比較低的可能原因之一。

影響外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有很多,如載體類型、宿主菌特征、外源基因結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)條件及營養(yǎng)狀況等,因此,對(duì)不同的基因必須對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,才能獲得最大程度的表達(dá)。因此在對(duì)水貂IFN-α做進(jìn)一步的研究中,可以對(duì)表達(dá)條件及載體等因素進(jìn)行選擇,選擇成熟的蛋白表達(dá)條件,進(jìn)而進(jìn)一步分析其蛋白特性及生物學(xué)功能,發(fā)揮其抗病毒的作用,為水貂及其他鼬類動(dòng)物的某些病毒性疾病的預(yù)防與治療提供新的思路。

[1]劉皓,焦丹,葛繼乾.干擾素國內(nèi)市場的現(xiàn)狀與發(fā)展分析[J].中國藥業(yè),2001,10(10):11-13.

[2]Schultz U,Chisari F V.Recombinant duck interferon gammainhibits duck hepatitis B virus replication in primary hepatocy tes[J].J Virol,1999,73(4):3162-3168.

[3]A rtursson K,Gobl A,Lindersson M,et al.M olecular cloning of agene encoding porcine interferon-beta[J].J Interferon Res,1992,12(3):153-160.

[4]黃道超,張志和,楊光友.大熊貓γ-干擾素基因的克隆與序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,30(1):35-38.

[5]薩姆布魯克J,拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂,王嘉璽,朱厚礎(chǔ),等譯.3版.北京:科學(xué)出版社,2002.

[6]馬云,孫大業(yè),孫穎.水稻類受體激酶OsCR4的抗體制備及特異性檢測[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2006,22(11):924-930.

[7]付加雷,宋長征,張更林.干擾素-tau的原核表達(dá)、純化和活性測定[J].中國生物工程雜志,2007,27(3):6-11.

[8]汪恭富,朱燕.干擾素在犬類疾病治療中的應(yīng)用[J].養(yǎng)犬,2006(1):23-24.

[9]連京華,李玉峰,高廣饒,等.獸用干擾素的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(1):78-80.