葡聚糖為白色的無(wú)定形粉末固體，無(wú)臭無(wú)味，易溶于水，不溶于酒精[1]。制糖過(guò)程中葡聚糖主要是腸膜明串珠菌分解的酶消耗蔗糖所生成的具有高粘性的物質(zhì)[2]，當(dāng)其含量達(dá)到一定程度時(shí)，其高粘性不僅造成甘蔗汁過(guò)濾、濃縮、結(jié)晶等后續(xù)操作困難，而且還造成糖分大量損失[3]。因此，定量分析制糖過(guò)程中葡聚糖含量至關(guān)重要。

目前國(guó)內(nèi)外葡聚糖測(cè)定方法雖然很多，但缺點(diǎn)都比較明顯。如Roberts-銅法需反復(fù)洗滌、多次過(guò)濾，操作步驟過(guò)多，使得測(cè)定結(jié)果誤差大；Haze-酒精沉淀法操作復(fù)雜、對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)苛、測(cè)得吸光度值過(guò)小等。因此，尋求一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的萄聚糖定量測(cè)定方法勢(shì)在必行。

葡聚糖酶屬于葡聚糖水解酶系，可以專一地分解葡聚糖，將葡聚糖降解成水溶性的還原糖[4],因此，可以通過(guò)測(cè)定還原糖的量，來(lái)定量推算葡聚糖的含量。酶解法定量測(cè)定葡聚糖因所用葡聚糖酶具有高效專一性、重復(fù)穩(wěn)定性好、樣品前處理簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，有望成為較有前景的葡聚糖定量測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

甘蔗汁由廣州甘蔗糖業(yè)研究所育種室提供；原糖由廣州甘蔗糖業(yè)研究所檢測(cè)中心提供。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.1 mol·L-1醋酸+0.1 mol·L-1醋酸鈉，pH=5.0)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2102PC型紫外分光光度計(jì)，Unico公司；AL204型電子天平、Seven Multi型pH計(jì)，Mettler toledo公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海宏精實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在標(biāo)號(hào)為1#～10#的比色管中分別加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL的1%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,并補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，其中0#比色管作為空白調(diào)零，然后依次加入2 mL DNS試劑，于沸水中煮沸5 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL， 30 min后于540 nm處測(cè)定OD值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 最適酶解時(shí)間的確定

用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制pH值為5(葡聚糖酶的最適酶解pH值)的濃度分別為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1T500葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液并加入0.5 mL酶活為200 U·mL-1的葡聚糖酶在55℃的水浴中分別反應(yīng)不同時(shí)間后，迅速滅活，加入2 mL DNS試劑進(jìn)行比色測(cè)定，同時(shí)做滅活樣對(duì)照。

1.2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣的回收率實(shí)驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)樣的回收率即葡聚糖酶在最適酶解時(shí)間內(nèi)對(duì)葡聚糖的分解率。

分別用T40、T500、T2000的葡聚糖配制濃度為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入0.5 mL 200 U·mL-1的葡聚糖酶在55℃的水浴中分別反應(yīng)20 min、60 min、90 min、120 min, 迅速滅活，加入2 mL DNS試劑進(jìn)行比色測(cè)定，同時(shí)做滅活樣對(duì)照。

1.2.3.2 試樣加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取新鮮甘蔗汁，用Roberts-銅法[5]測(cè)定葡聚糖含量；再在酶解法的沉淀溶解液中加入5 mL 0.2 mg·mL-1T500葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；最后用酶解法測(cè)定混合液的葡聚糖含量，計(jì)算回收率。

1.2.4 酶解法與Roberts-銅法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

酶解法測(cè)定甘蔗汁中葡聚糖含量：取經(jīng)過(guò)定性濾紙過(guò)濾的甘蔗汁5 mL，加入20 mL酒精，搖勻；在18 000 r·min-1、室溫條件下沉淀離心10 min；倒出上清液，取pH值為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5 mL，使離心沉淀溶解；取沉淀溶解液進(jìn)行比色測(cè)定，同時(shí)做滅活樣對(duì)照。在不同時(shí)間段取樣測(cè)定比較。同時(shí)采用Roberts-銅法測(cè)定甘蔗汁中葡聚糖含量。對(duì)比兩方法結(jié)果。

1.2.5 酶解法與Haze-酒精沉淀法[6]的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

酶解法測(cè)定原糖中葡聚糖含量：稱取3.0 g原糖，溶解于100 mL蒸餾水中，取溶解液5 mL，加入20 mL酒精，搖勻，后續(xù)操作同1.2.4。同時(shí)采用Haze-酒精沉淀法測(cè)定原糖中葡聚糖含量。對(duì)比兩方法結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(圖1)

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，葡萄糖濃度與OD值在0.1～1.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，擬合方程為y=0.8372x-0.0547，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

2.2 最適酶解時(shí)間的確定

不同濃度T500葡聚糖酶解產(chǎn)物的還原糖含量與酶解時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液最適酶解時(shí)間

由圖2可知,最適酶解時(shí)間隨葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不同而不同。葡聚糖酶對(duì)濃度為0.5 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的T500葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的最適酶解時(shí)間分別為20 min、60 min、90 min、120 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣的回收率

葡聚糖酶酶解不同分子量葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，酶解產(chǎn)物的還原糖含量與萄聚糖濃度的關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 不同分子量葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)酶解后產(chǎn)生的還原糖含量

由圖3可知,葡聚糖酶對(duì)不同分子量葡聚糖的分解率是相等的，分解率為56.0%。

2.4 試樣加標(biāo)回收率(表1)

表1 甘蔗汁中葡聚糖的回收率測(cè)定

從表1可以看出，甘蔗汁中葡聚糖的回收率結(jié)果良好，回收率在(100±5)%之間，因而可以肯定葡聚糖酶對(duì)葡聚糖的分解是專一性的。

2.5 酶解法與Roberts-銅法、Haze-酒精沉淀法比較

將透光度OD值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.8372x1-0.0547(酶解法標(biāo)準(zhǔn)曲線)、y2=0.9576x2+0.0073(Roberts-銅法標(biāo)準(zhǔn)曲線)和y3=0.000147x3+0.003168(Haze-酒精沉淀法標(biāo)準(zhǔn)曲線)，換算后得到葡聚糖含量，如表2、表3所示。

表2 酶解法與Roberts-銅法測(cè)定甘蔗汁中葡聚糖含量對(duì)比

表3 酶解法與Haze-酒精沉淀法測(cè)定原糖中葡聚糖含量對(duì)比

從表2、表3可以看出，酶解法與Roberts-銅法及Haze-酒精沉淀法測(cè)定葡聚糖含量相差不大，誤差均不超過(guò)±10%，在制糖誤差允許范圍之內(nèi)。用Roberts-銅法測(cè)定甘蔗汁中葡聚糖含量時(shí)，其相對(duì)誤差主要表現(xiàn)為正誤差，這可能是因?yàn)镽oberts-銅法需反復(fù)洗滌、多次過(guò)濾，操作步驟過(guò)多，使得葡聚糖流失過(guò)多。

3 結(jié)論

(1)葡聚糖酶對(duì)不同分子量葡聚糖的分解效果是相同的，分解率為56.0%。

(2)最適酶解時(shí)間隨葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不同而不同。

(3)用酶解法定量測(cè)定葡聚糖含量，其測(cè)定值與Roberts-銅法及Haze-酒精沉淀法(國(guó)標(biāo))相差不大，誤差均不超過(guò)±10%。

(4)酶解法定量測(cè)定葡聚糖含量具有高效、專一性強(qiáng)、污染小、操作簡(jiǎn)單、酶解產(chǎn)物分布穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)、但存在耗時(shí)長(zhǎng)、葡聚糖酶不能完全分解葡聚糖等缺點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 周文紅，劉慧霞，張建法，等.葡聚糖含量使糖度測(cè)定值虛假增加的影響研究[J].廣西糖業(yè)，2009，(3)：38-41.

[3] 梁達(dá)奉,曾練強(qiáng),郭亭,等.葡聚糖對(duì)制糖工業(yè)的影響及對(duì)策(上)[J].甘蔗糖業(yè)，2008，(3)：28-33.

[4] 譚海平.α-1，6-葡聚糖酶的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2001，28(1)：14-16.

[5] Roberts Earl J. A quantitative method for dextran analysis[J].Int Sugar J,1983,85(1009): 10-13.

[6] GB 15108-2006，原糖[S].