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(武漢生物工程學(xué)院生物工程系,湖北 武漢 430415)
殼聚糖酶(Chitosanase,EC3.2.2.99)又稱殼聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶,是一種分解殼聚糖的專一性酶,廣泛分布在細(xì)菌、真菌、病毒以及植物等生物群中[1]。酶降解法制備殼寡聚糖具有反應(yīng)條件溫和、寡糖得率高、不污染環(huán)境、產(chǎn)物安全性高等優(yōu)點(diǎn),是目前的發(fā)展方向。因此,對(duì)殼聚糖酶進(jìn)行深入研究并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)十分必要。
雙水相萃取(ATPS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的技術(shù),在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物活性物質(zhì)的分離純化方面受到廣泛重視。與傳統(tǒng)的分離方法相比,ATPS具有條件溫和、產(chǎn)品活性損失小、處理量大、分離步驟少、無(wú)有機(jī)溶劑殘留、設(shè)備投資小、操作簡(jiǎn)單、易于工程放大和連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn),非常適合大規(guī)模應(yīng)用[2,3]。
目前國(guó)內(nèi)對(duì)雙水相萃取法提取殼聚糖酶的研究和報(bào)道較少。作者利用PEG-(NH4)2SO4雙水相體系從Bacillussp.LS發(fā)酵液上清液中萃取分離殼聚糖酶,考察了影響萃取效果的各種因素,對(duì)雙水相萃取技術(shù)提取殼聚糖酶進(jìn)行了初步研究。
菌種Bacillussp.LS,自行篩選得到。
殼聚糖,成都科龍化工試劑廠;聚乙二醇(PEG,分子量為400、600、1000、4000、6000)、硫酸銨、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、考馬斯亮藍(lán)G250、D-(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽等均為分析純。
BS110S型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;722S型分光光度計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司;PHS-3C型精密pH計(jì),上海宇隆儀器有限公司;WH-90A型漩渦混合器,上海青浦滬西儀器廠。
1.2.1 粗酶液制備
低溫保藏的菌種經(jīng)過(guò)活化后,接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng),發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心后,收集上清液,4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 PEG-(NH4)2SO4雙水相體系的建立
稱取一定量PEG和(NH4)2SO4配制雙水相體系。體系總質(zhì)量為10.0 g,其中酶液量為2.0 g,不足部分用去離子水補(bǔ)足。混合均勻后,3000 r·min-1離心5 min,分相。分別測(cè)定上、下相體積,上、下相酶活和總蛋白濃度。計(jì)算相比(上、下相體積之比,R)、分配系數(shù)(上、下相酶比活力之比,K)、萃取率(上相總酶活與兩相總酶活之比,S)。
1.2.3 雙水相體系相圖的繪制
準(zhǔn)確量取一定量的PEG原液加入試管中,然后計(jì)量加入(NH4)2SO4溶液,混合,直至試管出現(xiàn)混濁。計(jì)量,算出PEG和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。再計(jì)量加入適量水,使體系變澄清,并繼續(xù)加入(NH4)2SO4溶液,使系統(tǒng)再次變混濁。如此反復(fù)操作,計(jì)算達(dá)到混濁時(shí)PEG和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù),繪制PEG-(NH4)2SO4體系的相圖。
1.3.1 酶活的測(cè)定
在1 mL1%膠體殼聚糖(用0.2 mol·L-1pH值5.0的醋酸緩沖溶液配制)中加入1 mL適當(dāng)稀釋的酶液,于50℃保溫反應(yīng)15 min,沸水浴10 min滅活,加入DNS 1.5 mL,沸水浴10 min,取出冷卻,3500 r·min-1離心15 min,取上清液在520 nm處測(cè)光吸收值。酶活單位定義為每分鐘催化生成相當(dāng)于1 μmol氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。
1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定
蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[4]。
圖1 PEG600-(NH4)2SO4雙水相體系相圖
由圖1可見(jiàn),在節(jié)線的上方區(qū)域可以形成雙水相。
固定PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,考察PEG相對(duì)分子量對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 PEG相對(duì)分子量對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響
由圖2可知,隨著PEG相對(duì)分子量的增加,殼聚糖酶的分配系數(shù)和萃取率均先增大后減小,當(dāng)PEG相對(duì)分子量為600時(shí)分配系數(shù)和萃取率均達(dá)到最大。因此,選擇PEG600進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
固定(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,考察PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響
由圖3可知,(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí),隨著PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)和萃取率均先增大后減小。這是因?yàn)殡S著PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,上相和下相相對(duì)組成的差別增大,殼聚糖酶在兩相中的表面張力差別也增大,有利于殼聚糖酶富集于上相中。但PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到一定程度時(shí),成相物質(zhì)間的作用增大,相界面張力亦增大,系統(tǒng)粘度也會(huì)增大,溶質(zhì)在相間的傳遞和在相內(nèi)的擴(kuò)散阻力大大增加[6],反而不利于殼聚糖酶進(jìn)入PEG相。綜合考慮,確定最佳的PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。
固定PEG600的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%,考察(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響
由圖4可知,PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí),隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)和萃取率均先增大后減小。(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí),分配系數(shù)和萃取率均達(dá)到最大值。隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加,影響到蛋白質(zhì)表面的疏水性,進(jìn)而影響到蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。因此,確定最佳(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。
圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響
由圖5可知,隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,分配系數(shù)和萃取率先增大后減小,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí),均達(dá)到最大值。這是因?yàn)?,NaCl粒子可能在兩相中有不同的分配系數(shù),隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,兩相間電位差發(fā)生變化,從而使殼聚糖酶的分配系數(shù)增加,但增加到一定的程度(超過(guò)0.1%)后,萃取相極性增強(qiáng),殼聚糖酶的溶解度下降而發(fā)生鹽析現(xiàn)象,蛋白質(zhì)傾向于分配到下相,分配系數(shù)和萃取率明顯下降。因此,確定最佳NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。
由圖6可知,隨著pH值的增加,分配系數(shù)和萃取率均先增大后減小,pH值為6.0時(shí),均出現(xiàn)最大值。體系pH值對(duì)殼聚糖酶的分配有很大影響,這是由于體系pH值的變化能明顯改變兩相的電位差[7], 最終影響到殼聚糖酶的分配系數(shù)和萃取率。因此, 確定萃取分離殼聚糖酶的雙水相體系的最佳pH值為6.0。
圖6 pH值對(duì)殼聚糖酶萃取效應(yīng)的影響
室溫下用PEG-(NH4)2SO4雙水相體系從Bacillussp.LS發(fā)酵液上清液中萃取殼聚糖酶,最佳提取條件為:PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、pH值6.0,在此條件下殼聚糖酶分配系數(shù)達(dá)5.91、萃取率達(dá)88.7%。
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