王智美,陳炳輝, 江春苗，萬茉莉

(1.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510224;2.中山大學(xué)地球科學(xué)系，廣東 廣州 510275)

粵北大寶山大型鐵銅多金屬礦的酸性礦山廢水(AMD)已使下游生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重的Pb、Zn、Cu、Cd等重金屬污染，引起了政府和有關(guān)媒體的廣泛重視。有關(guān)專家也對(duì)受大寶山礦區(qū)污染的水體和土壤中的重金屬含量、形態(tài)和危害性及生態(tài)環(huán)境退化等現(xiàn)象進(jìn)行了深入的研究工作，并探討了有關(guān)治理途徑[1-6]。事實(shí)上，大寶山礦業(yè)有限公司已經(jīng)投入大量的經(jīng)費(fèi)對(duì)尾礦庫進(jìn)行了處理，對(duì)民采產(chǎn)生的鐵龍尾礦壩也進(jìn)行了加高，但鐵龍尾礦水(pH低至2.5)還在繼續(xù)向下游排放(2008年11月18日現(xiàn)場(chǎng)考察)，進(jìn)入橫石河，最終流入翁江，不斷產(chǎn)生新的污染。

已有研究認(rèn)為，AMD的形成主要是由于礦山采冶過程中，黃鐵礦(FeS2)和其它硫化物礦物暴露后氧化作用形成的，而且在微生物如化能自養(yǎng)菌如Acidithiobacillusferrooxidans(以前稱Thiobacillusferrooxidans)(即氧化亞鐵硫桿菌)等的作用下,其氧化速度大大加快，特別是在pH<4的情況下，以生物化學(xué)氧化過程為主[7]。雖然國內(nèi)已有一些學(xué)者開始研究酸性礦山廢水中的微生物與硫化物礦物的相互作用及其環(huán)境效應(yīng)問題[8-10]，但對(duì)大寶山酸性礦山廢水中的微生物對(duì)硫化物礦物的氧化作用及其環(huán)境效應(yīng)等還未見有研究報(bào)道。

本文從粵北大寶山酸性礦山廢水(鐵龍尾砂庫選礦廢水和槽對(duì)坑尾砂庫選礦廢水)采集水樣，進(jìn)行pH值、部分陽離子和陰離子測(cè)定，并對(duì)其中的氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，初步研究了其生長(zhǎng)特性以及不同pH培養(yǎng)基溶液對(duì)AMD中重金屬含量的影響，為進(jìn)一步研究該礦區(qū)AMD中微生物對(duì)硫化物礦物的氧化作用及其環(huán)境效應(yīng)提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.1 采樣點(diǎn)及樣品采集

韶關(guān)曲江大寶山槽對(duì)坑尾砂庫和鐵龍尾砂庫共設(shè)采樣點(diǎn)5個(gè)，分別為鐵龍尾砂庫選礦廢水入水口(編號(hào)01，下同)，鐵龍尾砂壩出水口(02)，槽對(duì)坑尾砂庫選礦廢水入口(03)，槽對(duì)坑尾砂庫中央(04)，槽對(duì)坑尾砂壩出水口(05)，每個(gè)采樣點(diǎn)均取水樣，并現(xiàn)場(chǎng)用精密pH試紙測(cè)試其pH值。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

(NH4)2SO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O 、Ca(NO3)2、H2SO4、FeSO4·7H2O 、結(jié)晶紫、乙醇、草酸銨、碘、碘化鉀、沙黃,以上均為分析純(AR)；硝酸、高氯酸，均為優(yōu)級(jí)純(GR)，水為雙蒸水。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市宏華儀器廠);PHS-25型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠); 電子天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠)；DSX-280B型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠)；潔凈工作臺(tái)，潔凈等級(jí)100級(jí)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；IRIS(HR)等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)；DX-600離子色譜儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 9K培養(yǎng)基(選擇性培養(yǎng)基)配制

(NH4)2SO43.00 g，KCl 0.10 g，K2HPO40.10 g ，MgSO4·7H2O 0.50 g,Ca(NO3)20.01 g ，雙蒸水600.0 mL，用1∶1H2SO4調(diào)PH為2.00，在121 ℃滅菌15 min；取FeSO4·7H2O 44.30 g溶于400.0 mL雙蒸水,用同樣的方法將pH調(diào)為2.00，用孔徑為0.22 μm過濾器過濾除菌，然后將兩者混合。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1)菌株分離。將5份水樣靜置，各吸取10.00 mL上層清液接入100.0 mL 9K液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，第2天溶液顏色由淺綠色變成淺黃色；第4-6天淺黃色變成土黃色，錐形瓶?jī)?nèi)壁和瓶底逐漸生成一層黃色沉淀物；第7-9天顏色變成棕紅色并產(chǎn)生大量沉淀。培養(yǎng)期間，溶液顏色轉(zhuǎn)變成土黃色、并有沉淀生成時(shí)，進(jìn)行一次加富培養(yǎng)(FeSO4·7H2O為能源),培養(yǎng)直至錐形瓶中的溶液變成棕紅色不再改變并生成沉淀，停止培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)液，吸取上層清液進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)。

2)菌株純化。通過鏡檢結(jié)果挑選生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)液利用梯度稀釋方法進(jìn)行純化。取上述培養(yǎng)較好的培養(yǎng)液上層澄清液10.00 mL接入裝有100.0 mL 9K培養(yǎng)基的錐形瓶(1號(hào)瓶)中，兩者充分混合。然后從1號(hào)瓶中取出10.00 mL溶液放入到2號(hào)瓶中，依次類推到9號(hào)瓶(9號(hào)瓶取出的10.0 mL溶液舍棄)，進(jìn)行30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯變化，即淺綠色→淺黃色→土黃色→棕紅色，并出現(xiàn)沉淀，整個(gè)變化過程持續(xù)一周左右。最遲出現(xiàn)棕紅色的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的菌體為最純菌體。上述純化過程反復(fù)進(jìn)行，最終得到生命力較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)菌株M培養(yǎng)液。

3)實(shí)驗(yàn)菌體的生長(zhǎng)規(guī)律。吸取實(shí)驗(yàn)菌株M培養(yǎng)液10.00 mL接入100.0 mL的9K培養(yǎng)基中進(jìn)行30 ℃，150 r/min培養(yǎng)，在培養(yǎng)液剛轉(zhuǎn)變?yōu)樽丶t色并剛出現(xiàn)渾濁時(shí)即停止培養(yǎng)，用濾紙過濾。濾液用30 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體，用1∶1H2SO4調(diào)至pH為2.00的無菌水洗滌菌體，再次離心收集，重復(fù)3次，以除去可溶性的各種金屬離子，最后用pH 2.00無菌水懸浮菌體。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌懸液濃度為3.5×105個(gè)/mL。

分別吸取上述菌懸液10.00 mL接種到6個(gè)分別裝有100.0 mL 9K培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，進(jìn)行30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，每隔12h計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量、測(cè)量pH值，培養(yǎng)7 d后將沉淀物收集，用X射線衍射分析。

2.3 水樣中陽離子和陰離子含量測(cè)定

2.4 不同pH培養(yǎng)基溶液對(duì)AMD重金屬含量的影響實(shí)驗(yàn)

陸建軍等[10]認(rèn)為，礦山環(huán)境中生物參與形成的鐵硫酸鹽礦物具有很高的比表面積和表面能，可作為理想的吸附劑；當(dāng)pH=3時(shí)，酸礦水存在相對(duì)較多的氧化亞鐵硫桿菌，污染元素降到最低[8]。

為了研究氧化亞鐵硫桿菌的作用下，AMD的pH值對(duì)溶液重金屬含量的影響，選取pH值為1.9、2.0、2.5和3.0分別配制9K培養(yǎng)基50.0 mL。各吸取鐵龍尾砂壩出水口水樣(02樣品)5.00 mL,分別接入不同pH值的9K培養(yǎng)基中，并且同步配制試劑空白，用30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)10 d，用濾紙過濾除去沉淀物。濾液用ICP-AES進(jìn)行Cd2+，Cu2+，Zn2+，Pb2+的含量測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 水樣的pH值和離子含量

對(duì)編號(hào)01-05 的5個(gè)水樣進(jìn)行pH測(cè)定，結(jié)果分別為2.5、2.5、3.0、3.5和3.5，02和05號(hào)水樣的陽離子和陰離子的含量分別如表1所示。

表1 水樣的離子濃度

3.2 菌體的生物特性和生長(zhǎng)規(guī)律

1) 形態(tài)特征。菌體為短桿狀，革蘭氏染色陰性(圖1)。

圖1 革蘭氏染色氧化亞硫鐵桿菌的形態(tài)

2) 生長(zhǎng)規(guī)律。菌體生長(zhǎng)規(guī)律實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如圖2所示。細(xì)菌菌數(shù)和pH值均呈先升后降趨勢(shì)。0～12 h細(xì)菌菌數(shù)無明顯變化；24～36 h細(xì)菌菌數(shù)快速增長(zhǎng)；36～48 h菌數(shù)逐漸下降。0～36 h pH值逐漸升高；36～48 h pH值逐漸降低。沉淀物X衍射分析結(jié)果(圖3)表明，黃色沉淀物主要成分為黃鉀鐵礬(KFe3(SO4)2(0H)6)。

圖2 溶液中細(xì)菌(A.f.) 數(shù)量和pH值隨時(shí)間的變化

圖3 黃色沉淀物(黃鉀鐵礬)的X射線衍射譜

由于0～12 h氧化亞鐵硫桿菌處于誘導(dǎo)期，受到外環(huán)境改變的影響，數(shù)量增加緩慢，因此菌液值變化不明顯；24～36 h氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，桿菌繁殖增快，值亦隨之升高，生長(zhǎng)周期內(nèi)細(xì)菌個(gè)數(shù)最高達(dá)到120×105個(gè)/mL，pH值最高為2.35；36～48 h，桿菌進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期及衰退期，菌液pH值亦隨之降低[12]。沉淀物黃鉀鐵礬的形成過程可由下列方程式表示[9,13]：

KFe3(SO4)2(OH)6+8H+

上述研究表明，黃鉀鐵礬的生成是溶液pH值下降的主要原因。

3)溶液的pH對(duì)重金屬含量的影響。表2表示氧化亞鐵硫桿菌在不同pH值的培養(yǎng)基下，培養(yǎng)10 d后，溶液中幾種重金屬離子的含量。由此可見，在pH值為2.0～2.5時(shí)，溶液中的重金屬離子含量相對(duì)較高；而pH值為3.0時(shí)，被測(cè)定的金屬離子含量降低。表明在pH為2.0～2.5時(shí)，即氧化亞鐵硫桿菌相對(duì)數(shù)量較多時(shí)，溶液的重金屬含量反而比較高，結(jié)果與前人的研究結(jié)論不同[8]，有待進(jìn)一步研究。

表2 不同pH培養(yǎng)基中AMD溶液的重金屬離子含量

分析單位：中山大學(xué)測(cè)試中心

4 結(jié) 論

2)利用9K培養(yǎng)基從大寶山酸性礦山廢水中培養(yǎng)出了氧化亞鐵硫桿菌，菌體為短桿狀，革蘭氏染色陰性。培養(yǎng)過程中細(xì)菌菌數(shù)和溶液pH值均呈先升后降趨勢(shì)。0～12 h細(xì)菌菌數(shù)無明顯變化；24～36 h細(xì)菌菌數(shù)快速增長(zhǎng)；36～48 h菌數(shù)逐漸下降；即細(xì)菌生長(zhǎng)經(jīng)歷誘導(dǎo)期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定生長(zhǎng)期及衰退期。0～36 h pH值逐漸升高；36～48 h值pH逐漸降低。

3)培養(yǎng)過程中出現(xiàn)黃色沉淀物，其主要成分為黃鉀鐵礬。黃鉀鐵礬的生成是溶液pH值下降的主要原因。

4)利用pH為2.0～2.5的9K培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，AMD溶液中的Cd2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+等重金屬離子的含量較高，pH為3.0時(shí)降低。

5)大寶山鐵龍尾礦水不僅應(yīng)加入石灰等進(jìn)行中和處理[4]，更重要的是由于尾礦水中存在的氧化亞鐵硫桿菌會(huì)加速硫化物礦物的氧化作用，應(yīng)充分考慮利用微生物治理技術(shù)進(jìn)行有效治理。

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