黃大毛，孟菁菁，謝春蕾，吳尚輝，顧煥華，唐發(fā)清

（中南大學(xué) 1.湘雅醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410008；2.湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，湖南 長沙 410078）

小檗堿（Berberine，BBR）是毛莨科植物黃連（Coptis chinensis Franch）根莖提取的主要的有效成分，分子式為[C20H18NO4]+，分子量為336.37。BBR不僅具有廣譜的抗菌消炎的藥理作用，而且具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌的防治中，BBR具有重要作用。BBR或含BBR的藥物能夠降低鼻咽癌高危人群EBV相關(guān)抗體滴度或使其轉(zhuǎn)為陰性[1，2]，抑制 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）潛伏感染，降低鼻咽癌的發(fā)病率[3]。為進(jìn)一步明確BBR抑制EB病毒潛伏感染療效和闡明BBR作用的機(jī)制，本文以帶EB病毒的Raji細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究小檗堿對EB病毒復(fù)制的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 Raji細(xì)胞（ATCC CCL86）購自中南大學(xué)分析測試中心細(xì)胞生物研究室。Raji細(xì)胞是攜帶和自主復(fù)制EBV基因的人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞，懸浮生長，聚集成團(tuán)，體積較大，折光性較強(qiáng)。

1.1.2 主要儀器和試劑 Mx3000p型熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司。鹽酸小檗堿（Berberine Chloride），C20H18ClNO4購自 Sigma公司（633-65-8），MTT試劑購自 Sigma公司（57360-69-7）。Hyclone改良型RPMI1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司。病毒DNA小劑量抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。Taq DNA聚合酶、dNTPs購自廣州達(dá)安基因股份有限公司。其它儀器試劑均由中南大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心細(xì)胞生物研究室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Raji細(xì)胞株接種到含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 取對數(shù)生長期Raji細(xì)胞，用含藥培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液），每組設(shè)置4個(gè)平行孔，于37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入20μL MTT溶液，輕輕搖勻，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。1000 r/min離心10 min，棄去上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測量各孔的吸光度值。

1.2.3 巢式熒光定量PCR檢測EBV-DNA ①標(biāo)準(zhǔn)品的制備：取Raji細(xì)胞凍存液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道的每個(gè)Raji細(xì)胞約含有50個(gè)拷貝的EBV-DNA進(jìn)行計(jì)算，得到Raji細(xì)胞凍存液中E BV-DNA的濃度為2.9×105拷貝/μL。②巢式熒光定量PCR檢測EBV-DNA：使用病毒DNA小量抽提試劑盒從培養(yǎng)的Raji細(xì)胞中抽提病毒DNA，操作步驟按試劑盒說明書（稍加改進(jìn)）進(jìn)行。選擇EB病毒DNA全序列20206～20426位為外擴(kuò)增區(qū)，20279～20343位為內(nèi)擴(kuò)增區(qū)，熒光探針在內(nèi)擴(kuò)增區(qū)內(nèi)20299～20318位。外擴(kuò)增引物：上游引物為5'-TC AAAACTTTAGAGGCGAATGG-3'，下游引物為5'-CTGAGAAGGTGGCCTAGCAAC-3'，擴(kuò)增片段長度為221 bp。內(nèi)擴(kuò)增引物：上游引物為5'-CCA GGAAGCGGGTCTATGG-3'，下游引物序列為5'-GGCTTATTCCTCTTTTCCCCT CTA-3'，擴(kuò)增片段長度為 65 bp。熒光探針：Taqman探針序列5'-FAM-TGGCTGCGCTGCTGCTATC-TAMRA-3'。擴(kuò)增引物、探針由廣州達(dá)安基因股份有限公司設(shè)計(jì)合成。標(biāo)準(zhǔn)品的外擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：將Raji細(xì)胞抽提的EBV-DNA稀釋成一定濃度梯度（1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷貝 /50μL反應(yīng)體系）。50μl反應(yīng)體系：5×定性緩沖液10μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 1μL，上游外引物1μL，下游外引物1μL，標(biāo)準(zhǔn)品nμL（n為根據(jù)濃度計(jì)算的體積0.40），加水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。樣品的外擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：50μL反應(yīng)體系：5×定性緩沖液 10μL，Taq DNA聚合酶 1μL，dNTPs 1μL，上游外引物 1μL，下游外引物1μL，模板10μL，加水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。內(nèi)擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：標(biāo)準(zhǔn)品與樣品相同。50μl反應(yīng)體系：5×定量緩沖液 10μL，Taq DNA聚合酶 1μL，dNTPs 1μL，上游內(nèi)引物1μL，下游內(nèi)引物1μL，Taqman探針1μL，外擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，加水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃ 45s，55℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩個(gè)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)以及獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測BBR對Raji細(xì)胞的細(xì)胞無毒性濃度

為觀察BBR對鼻咽癌細(xì)胞生長的影響，采用MTT法分析不同濃度（100、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0μmol/L）BBR 處 理Raji細(xì)胞后細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，在BBR濃度分別為 10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)與空白組比較無明顯差異（P＞0.05），而 BBR 濃度為 100、80、40、20μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組（P＜0.05），且細(xì)胞數(shù)隨BBR濃度的增高而減少（圖2），表明高濃度（10μmol/L以上）BBR對Raji細(xì)胞增殖生長有明顯的抑制作用。鑒于在10μmol/L以下濃度的BBR對Raji細(xì)胞生長增殖沒有明顯影響，因而BBR對Raji細(xì)胞的細(xì)胞無毒性濃度為0～10μmol/L。

圖1 BBR分子結(jié)構(gòu)

圖2 BBR對Raji細(xì)胞的抑制作用

2.2 不同濃度BBR對Raji細(xì)胞形態(tài)的影響

為進(jìn)一步確證細(xì)胞無毒性濃度的BBR對Raji細(xì)胞生長的影響，用倒置顯微鏡觀察不同濃度（40、10、1.25μmol/L）BBR處理的Raji細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明，用細(xì)胞無毒性濃度的BBR（10、1.25μmol/L）處理的Raji細(xì)胞，與對照組細(xì)胞一樣呈懸浮生長，生長良好，細(xì)胞呈圓形、體積較大、折光性強(qiáng)。當(dāng)BBR濃度為40μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，細(xì)胞散在生長且未聚集成團(tuán)，體積略小，折光性較低（圖3）。

圖3 不同濃度BBR處理后的Raji細(xì)胞形態(tài)

2.3 巢式熒光定量PCR檢測EBV-DNA表達(dá)

2.3.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 用稀釋成不同濃度的Raji細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)得出擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線（圖4）及熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 不同濃度BBR處理Raji細(xì)胞后EBV-DNA拷貝數(shù)的變化

2.3.2 不同濃度BBR處理的Raji細(xì)胞中EBV-DNA表達(dá) 運(yùn)用巢式熒光定量PCR方法分別檢測不同濃度 BBR（40、10、1.25 和 0μmol/L）處理的Raji細(xì)胞中EBV-DNA表達(dá)，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同藥物濃度處理的Raji細(xì)胞中EBV-DNA的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，細(xì)胞無毒性濃度的BBR（10、1.25μmol/L）處理 Raji細(xì)胞后，EBV-DNA的拷貝數(shù)明顯低于未經(jīng)藥物處理組（P＜0.05），見圖6。

3 討論

鼻咽癌是我國南方一種常見的頭頸部惡性腫瘤，鼻咽癌確切發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前無法進(jìn)行鼻咽癌的一級預(yù)防。研究表明，EBV的感染與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5，6]，EB病毒不僅參與了鼻咽癌各階段，而且EB病毒潛伏感染的程度，如EB病毒相關(guān)抗體滴度和DNA拷貝數(shù)，間接提示鼻咽癌疾病狀態(tài)，尤其是鼻咽癌高危人群的預(yù)防方面，已經(jīng)將降低和清楚EB病毒潛伏感染作為鼻咽癌高危人群預(yù)防一項(xiàng)重要指標(biāo)[7，8]。

BBR是一種異喹啉生物堿，為白毛茛、黃柏、黃連等植物藥的主要成分，具有抗菌、抗感染、解熱鎮(zhèn)痛等作用[9]。近年來，BBR又被證實(shí)具有抗腫瘤作用[10，11]。BBR 抗腫瘤機(jī)制研究表明，BBR通過抑制COX-2[12]、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶[13]以及與DNA形成復(fù)合物[14，15]等方式，抑制腫瘤細(xì)胞的 DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成；通過抑制激活蛋白-1（AP-1）的活性，阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路等，最終抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。在我們的前期研究工作中，用BBR或含BBR的中藥復(fù)方進(jìn)行鼻咽癌高危人群預(yù)防[1]，發(fā)現(xiàn)其能降低鼻咽癌高危人群EBV相關(guān)抗體滴度或使其轉(zhuǎn)為陰性[2]，進(jìn)而抑制EBV潛伏感染，降低鼻咽癌的發(fā)病率[3]。在增強(qiáng)鼻咽癌患者放射治療的敏感方面，BBR的中藥復(fù)方降低鼻咽癌患者EBV相關(guān)抗體，增強(qiáng)鼻咽癌放療的敏感性[17]。由此，我們推測在BBR可能干預(yù)EBV病毒復(fù)制，進(jìn)而降低鼻咽癌組織或者血漿中EBV-DNA的含量。

本文采用巢式-熒光定量PCR方法檢測BBR處理Raji細(xì)胞后EBV-DNA拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BBR能夠明顯抑制Raji細(xì)胞中EBV-DNA復(fù)制，且呈藥物濃度依賴性。此結(jié)果提示，BBR也可能通過抑制鼻咽癌細(xì)胞EBV-DNA的復(fù)制降低鼻咽癌的發(fā)生。在本項(xiàng)目研究中，為排除因藥物毒性作用而對細(xì)胞生長產(chǎn)生影響，我們采用MTT法篩選BBR的無細(xì)胞毒性濃度，該濃度對細(xì)胞生長增殖沒有明顯毒性，因而我們認(rèn)為BBR對Raji細(xì)胞EBV-DNA復(fù)制抑制作用不是因?yàn)槠浔旧矶拘宰饔糜绊懠?xì)胞生長，而是小檗堿的藥理學(xué)作用，其具體作用分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

BBR抑制EBV-DNA的復(fù)制，因而可以阻斷EBV致癌作用，降低鼻咽癌的發(fā)生率。另外，BBR在治療過程中毒性較小以及價(jià)格低廉，因而，在鼻咽癌的一級預(yù)防應(yīng)用中有潛在臨床應(yīng)用前景。

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