劉 濤，謝民強(qiáng)

（1.廣州中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州510630；2.廣州南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州510282）

鼻咽癌是中國南方常見的一種高轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，往往在疾病的早期即發(fā)生組織侵襲和轉(zhuǎn)移，但其生物學(xué)機(jī)制仍不清楚[1]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）是基底膜及細(xì)胞外間質(zhì)的蛋白水解酶，能促進(jìn)惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[2]。其中，MMP家族成員中的MMP9主要降解Ⅳ型膠原，使基底膜破壞，啟動腫瘤細(xì)胞侵襲的起始階段[3]。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，人鼻咽癌組織中MMP9高表達(dá)可能與鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[4～6]，但具體機(jī)制尚不清楚。為進(jìn)一步明確鼻咽癌細(xì)胞中MMP9基因在體內(nèi)和體外表達(dá)有無差別，以及這種差別與鼻咽癌的侵襲有何關(guān)系，本文采用RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)對鼻咽癌細(xì)胞株 CNE1、CNE2、HNE1、HNE2 和 SUNE1 及CNE2、HNE1裸鼠成瘤瘤塊中MMP9基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

鼻咽癌細(xì)胞株：CNE1、CNE2、HNE2 均購自中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫，HNE1購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，SUNE1購自南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所。

Trizol購自Invitrogen公司，Taq酶及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ K1621）購自Fermentas公司。濃縮型MMP9鼠抗人單克隆抗體購自Abcam公司。SABC試劑盒、羊抗鼠IgG及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自KPL公司。蛋白裂解液購自PIERCE公司。免疫印跡（Western Blot）試劑盒 ECL購自Amersham公司。硝酸纖維素膜及低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)志物購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)于10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)至細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部70%～80%時(shí)，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鼻咽癌細(xì)胞株中的MMP9蛋白表達(dá)的檢測培養(yǎng)瓶內(nèi)放入蓋玻片，待細(xì)胞爬片融合到95%～100%時(shí)，以4%多聚甲醛固定20～30 min，采用SABC法進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，一抗為濃縮型MMP9鼠抗人單克隆抗體，1∶100稀釋，具體染色步驟參照說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對照。細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。

取對數(shù)生長期CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、SUNE1細(xì)胞，1×107個(gè)/mL （約50 mL培養(yǎng)瓶），蛋白提取：用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液400μL裂解細(xì)胞，冰盒上刮下細(xì)胞，4℃、10000 r/min離心10 min，收集上清，-20℃保存。Bradford比色法測定蛋白濃度定量，調(diào)節(jié)蛋白濃度一致后，行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉37℃封閉1h，與鼠抗人MMP9一抗（1∶500稀釋）4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次，每次15 min，然后加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶5000稀釋），37℃孵育1 h后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)，膠片掃描保存。

1.2.3 鼻咽癌細(xì)胞株中的MMP9 mRNA表達(dá)的檢測 收獲對數(shù)生長期的鼻咽癌細(xì)胞，用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。全部引物采用Primer3軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。引物序列和產(chǎn)物大小見表1?；驍U(kuò)增反應(yīng)體系為：2.5μL的 10×PCR 緩沖液，2μL cDNA，1μL dNTPs（2.5 mmol/L），上下游引物各 0.5μL（10 pmol/L），Taq 聚合酶 0.25μL（5U/μL），用 RNase Free dH2O加至25μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性 4 min；然后 94℃變性 30 s，61℃（MMP9）/55℃（β-actin）復(fù)性 30 s，72℃延伸 30 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈觀察并照相。

1.2.4 HNE1和CNE2細(xì)胞裸鼠成瘤瘤塊組織中MMP9的表達(dá) 5～7周齡 BALB/c nu裸小鼠 10只，在SPF環(huán)境（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心動物實(shí)驗(yàn)部）中飼養(yǎng)，將對數(shù)生長期的人鼻咽癌HNE1和CNE2細(xì)胞分別以10×107個(gè)/mL及5×107個(gè)/mL的密度接種于裸鼠腋后背部皮下，每組5只，每只接種劑量0.2 mL。待瘤塊長至直徑10 mm左右后處死裸鼠，迅速解剖剝離腫瘤，以4%多聚甲醛液固定24 h，梯度酒精脫水、透明，石蠟包埋連續(xù)切片，SABC法檢測組織中MMP9的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 5株鼻咽癌細(xì)胞MMP9免疫組化檢測結(jié)果

HNE1和SUNE1細(xì)胞中MMP9蛋白呈陽性表達(dá)，CNE1、CNE2及HNE2中未見到細(xì)胞MMP9蛋白的表達(dá)。結(jié)果見圖1。

2.2 鼻咽癌細(xì)胞系中MMP9 mRNA的表達(dá)

以β-actin為內(nèi)對照，應(yīng)用RT-PCR方法檢測了鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2 及SUNE1中MMP9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，5株鼻咽癌細(xì)胞均有MMP9 mRNA表達(dá)，以HNE1和SUNE1表達(dá)較強(qiáng)，后者與免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果一致。

2.3 鼻咽癌細(xì)胞系中MMP9蛋白的表達(dá)

表1 PCR引物序列和產(chǎn)物大小

圖1 MMP9在 CNE1、CNE2、HNE1、HNE2和SUNE1細(xì)胞中的表達(dá)情況（×200）

圖2 RT-PCR法檢測鼻咽癌細(xì)胞系MMP9 mRNA表達(dá)水平

圖3 Western Blot檢測鼻咽癌細(xì)胞系MMP9蛋白表達(dá)

圖4 MMP9在CNE2及HNE1細(xì)胞裸鼠成瘤瘤塊中的免疫組化陽性染色（×400）

Western Blot檢測結(jié)果如圖3所示。HNE1和SUNE1細(xì)胞中MMP9蛋白高表達(dá)，分別在92KD和83KD處檢測到酶原及酶的條帶。CNE1、CNE2及HNE2細(xì)胞中無明顯MMP9蛋白表達(dá)。

2.4 鼻咽癌細(xì)胞株裸鼠成瘤瘤塊MMP 9的免疫組化結(jié)果

HNE 1及CNE 2細(xì)胞各5只裸鼠種瘤均成功，瘤塊組織中MMP 9均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。結(jié)果見圖4。

3 討論

鼻咽癌是我國常見的一種惡性腫瘤，臨床上易早期發(fā)生組織侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，探討鼻咽癌浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)制具有非常重要的臨床和理論意義。

腫瘤細(xì)胞降解基底膜和侵入下層的結(jié)締組織是上皮性惡性腫瘤局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，而MMP在此過程中起重要作用。MMP是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶類，其活性異常與腫瘤侵襲能力和轉(zhuǎn)移發(fā)生密切相關(guān)，惡性腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)者其侵襲周圍組織能力明顯增強(qiáng)，且更易發(fā)生淋巴結(jié)和血道轉(zhuǎn)移，預(yù)后明顯較差。在MMP家族成員中，MMP 9主要降解Ⅳ型膠原。其中，Ⅳ型膠原是構(gòu)成B M的主要支架和成分，腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移首先須發(fā)生B M的降解，即Ⅳ型膠原破壞就意味著腫瘤細(xì)胞的浸潤或即將發(fā)生浸潤。已有研究發(fā)現(xiàn)，MMP 9在多種惡性腫瘤中具有高表達(dá)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7，8]。

國內(nèi)外學(xué)者研究認(rèn)為，MMP 9有促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，可引起頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3～6]。近來已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MMP 9與鼻咽癌顱內(nèi)侵犯密切相關(guān)[9]。

然而，MMP 9在鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用細(xì)胞免疫組化、Western Blot和RT-PCR方法，檢測了MMP 9在鼻咽癌細(xì)胞系中MMP 9的表達(dá)。結(jié)果顯示，在鼻咽癌細(xì)胞系中，有HNE1及SUNE1多株細(xì)胞MMP 9較強(qiáng)表達(dá)。

通過不同的鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE2裸鼠成瘤研究我們還發(fā)現(xiàn)，HNE1細(xì)胞在體內(nèi)外MMP 9蛋白表達(dá)均較強(qiáng)。CNE2細(xì)胞MMP 9蛋白表達(dá)陰性，而該細(xì)胞裸鼠成瘤后表達(dá)強(qiáng)陽性，推測與體內(nèi)外環(huán)境改變有關(guān)。通常在科研工作中，選擇各種細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的實(shí)驗(yàn)是很常見的工作。但研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表型受到周圍微環(huán)境，特別是周圍細(xì)胞的細(xì)胞相互作用的影響，培養(yǎng)細(xì)胞可能因微環(huán)境改變或失去周圍細(xì)胞的相互作用而使基因表型發(fā)生改變。在細(xì)胞水平獲得的結(jié)果并不能完全代表體內(nèi)的情況，所以在細(xì)胞水平取得的結(jié)果，如果能在組織中獲得進(jìn)一步的驗(yàn)證，其結(jié)果將更為可靠。本文通過MMP9蛋白表達(dá)較強(qiáng)的HNE1細(xì)胞和MMP9蛋白表達(dá)陰性的CNE2細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤瘤塊免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，兩者均有MMP9的強(qiáng)表達(dá)，進(jìn)一步說明MMP9在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)，可能在鼻咽癌浸潤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。

綜上，本文初步研究得出MMP9在鼻咽癌細(xì)胞系中具有高表達(dá)，其可能參與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。通過探討鼻咽癌細(xì)胞系MMP9的表達(dá)及其改變與鼻咽癌成瘤性侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的關(guān)系研究，為今后研究鼻咽癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制并進(jìn)行干預(yù)打下基礎(chǔ)。

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