人們?cè)谂潴w-蛋白相互作用方面的研究取得了很大的進(jìn)展，可采用多種方法測(cè)定配體-蛋白相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

核磁共振波譜(NMR)方法可用于分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)研究，包括蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-配體絡(luò)合物的溶液結(jié)構(gòu)測(cè)定、同位素編輯/濾波或核Overhauser效應(yīng)(NOE)技術(shù)迅速測(cè)定蛋白-配體絡(luò)合物中配體的結(jié)構(gòu)[1]。在配體與受體發(fā)生作用時(shí)，許多NMR參數(shù)將發(fā)生變化。NMR方法可以通過(guò)幾種途徑測(cè)定藥物和蛋白的相互作用，如化學(xué)位移、線寬變化、轉(zhuǎn)移NOE及脈沖梯度場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等[2～5]。

Langmuir吸附等溫方程[6]是物理化學(xué)中用以描述氣體分子在固體表面吸附和脫附動(dòng)力學(xué)平衡的方程，可用于研究氣體和固體的相互作用及液體和固體的相互作用[7]。

作者在此研究了水溶液中膽紅素(BR)與牛血清白蛋白(BSA)的低親合力相互作用，結(jié)合NMR動(dòng)力學(xué)測(cè)量、Langmuir吸附等溫方程測(cè)定牛血清白蛋白對(duì)膽紅素的最大結(jié)合中心數(shù)目(n)，并推斷配體-生物大分子絡(luò)合物的絡(luò)合常數(shù)(K)，為該領(lǐng)域的研究開(kāi)辟了一條新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白，中國(guó)華美生物工程公司；膽紅素，瑞士Fluka Chemika；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

Unity Inova 600型核磁共振譜儀，美國(guó)瓦里安公司。

1.2 原理

Langmuir吸附等溫方程采用了兩個(gè)基本假定：第一，固體具有吸附能力是因?yàn)槲絼┍砻娴脑恿?chǎng)沒(méi)有飽和，有剩余價(jià)力。當(dāng)氣體分子碰撞到固體表面時(shí)，其中一部分就被吸附并放出吸附熱，但是氣體分子只有碰撞到尚未被吸附的空白表面才能夠發(fā)生吸附作用；當(dāng)固體表面已覆蓋滿一層吸附分子，這種力場(chǎng)得到了飽和，因此吸附是單分子層的。第二，已吸附在吸附劑表面上的分子，當(dāng)其熱運(yùn)動(dòng)的動(dòng)能足以克服吸附劑引力場(chǎng)的位壘時(shí)，又重新回到氣相。再回到氣相的機(jī)會(huì)不受鄰近其它吸附分子的影響，也不受吸附位置的影響。換言之，被吸附的分子之間不互相影響，并且表面是均勻的。

與膽紅素相比，分子量高達(dá)66 000 Da的BSA分子能夠提供足夠大的表面吸附或者結(jié)合膽紅素分子。由于膽紅素與蛋白間的低親合力，其相互作用很弱，結(jié)合態(tài)和游離態(tài)膽紅素分子處于快速交換中，因此可以合理地假設(shè)Langmuir吸附等溫方程的兩個(gè)基本假定適用于BR與BSA的低親合力相互作用。結(jié)合過(guò)程可用式(1)描述:

BR+BSA=Complex

(1)

假設(shè)每一個(gè)BSA分子最多有n個(gè)結(jié)合中心可用于接受BR分子，則:

ncP=[LB]+[P]

(2)

cL=[LF]+ [LB]

(3)

式中：cP、cL分別為溶液中BSA和BR的總濃度；[P]為BSA分子中游離態(tài)結(jié)合中心的濃度；[LF]、[LB]分別為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)BR的濃度。

由Langmuir吸附等溫方程的兩個(gè)基本假定，可以得到:

吸附速率=k1[LF](ncP-[LB])

(4)

脫附速率=k-1[LB]

(5)

當(dāng)吸附過(guò)程和脫附過(guò)程達(dá)到平衡，則吸附速率等于脫附速率，式(4)和式(5)右邊也相等。這樣，就得到與Langmuir吸附等溫方程類似的方程：

(6)

(7)

式中：K=k1/k-1= [LB]/{[LF](ncP-[LB])}，是BR-BSA絡(luò)合物的絡(luò)合平衡常數(shù)。

一旦得到了[LB]和[LF]的具體數(shù)據(jù)，將1/[LB]對(duì)1/[LF]作圖并用式(7)擬合所得直線，就可以同時(shí)得到兩個(gè)參數(shù)：n和K。

[LB]和[LF]的具體數(shù)據(jù)可通過(guò)NMR測(cè)量獲得。某些NMR參數(shù)，如馳豫速率和自擴(kuò)散系數(shù)的觀測(cè)值(Yobs)，應(yīng)該是游離態(tài)和結(jié)合態(tài)分子相應(yīng)參數(shù)的權(quán)重平均值，即：

Yobs=XBYB+XFYF=XB(YB-YF)+YF

(8)

式中：Yobs為馳豫速率或自擴(kuò)散系數(shù)的觀測(cè)值；YB、YF分別為結(jié)合態(tài)和游離態(tài)BR分子的馳豫速率觀測(cè)值；XB、XF分別為結(jié)合態(tài)和游離態(tài)BR分子的摩爾分?jǐn)?shù)，XB=[LB]/cL，XF=[LF]/cL。

通過(guò)改變BSA與BR的濃度比cP/cL測(cè)量一系列Yobs數(shù)據(jù)，將此數(shù)據(jù)對(duì)cP/cL作圖，分別外推cP/cL到0和無(wú)窮大，就可以得到Y(jié)F和YB。根據(jù)式(6)～(8)就可計(jì)算出[LB]和[LF]。

1.3 方法

定量溶解BR于溶液中,得到9個(gè)NMR樣品，其中BSA濃度均為4.00×10-5mol·L-1，BR濃度(×10-3mol·L-1)則分別為6.33、5.50、5.13、4.95、4.40、4.00、3.42、3.30、2.80，對(duì)應(yīng)BSA與BR濃度比(cP/cL)分別為：1∶158、1∶138、1∶128、1∶124、1∶110、1∶100、1∶85.5、1∶82.5、1∶70.0,含有10%(體積分?jǐn)?shù))的重水(D2O)。在310 K下測(cè)定樣品的自旋晶格馳豫時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 核磁圖譜

BR溶液的1HNMR圖譜如圖1所示。

cBR:5.50×10-3 mol·L-1 cBSA:4.00×10-5 mol·L-1

由圖1可看出，由于BSA濃度很小，加之存在快速馳豫而引起譜線加寬現(xiàn)象，所以在含BSA的樣品溶液中BSA信號(hào)都很弱。同時(shí)，由于溶液的高粘度及結(jié)合態(tài)和游離態(tài)分子間交換所造成的影響，含BSA的樣品溶液中所有來(lái)自BR的信號(hào)也都變寬了，由于微環(huán)境的改變，化學(xué)位移值均發(fā)生了一定改變。

2.2 馳豫時(shí)間

測(cè)定BR分子中2-CH3中H的縱向馳豫時(shí)間，馳豫速率的觀測(cè)值Yobs隨BSA與BR濃度比(cP/cL)的變化如圖2所示。

圖2 BR分子的2-CH3中H的馳豫速率觀測(cè)值隨濃度比(100cP/cL)的變化曲線

從圖2可以看出，隨著濃度比cP/cL的增大，馳豫速率的觀測(cè)值Yobs不斷增大。

外推cP/cL為無(wú)窮大，可得YB=1.85 s-1；外推cP/cL為0，得YF=0 s-1。由式(8)所描述的快速交換模型及XB和XF的定義，可計(jì)算出一系列[LF]和[LB]值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 含4.00×10-5 mol·L-1 BSA的BR溶液的馳豫速率觀測(cè)值

將1/[LB]對(duì)1/[LF]作圖(圖3)，用式(7)擬合所得直線，得到BR-BSA絡(luò)合物的表觀絡(luò)合常數(shù)K=36.0 L·mol-1，BSA分子上的最大結(jié)合中心數(shù)目n=98。

圖中直線為L(zhǎng)angmuir吸附等溫方程(式7)的擬合結(jié)果

2.3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用的模型適用于游離態(tài)和結(jié)合態(tài)配體快速交換的體系。對(duì)于慢交換體系，式(8)不再有效，因?yàn)榇藭r(shí)NMR信號(hào)非常寬，無(wú)法測(cè)得YB，因而也就無(wú)法計(jì)算Yobs。血清白蛋白的X-射線研究和很多光譜研究結(jié)果表明，在BSA分子上與配體結(jié)合的高親合力結(jié)合中心數(shù)目一般為1或2[8,9]。由于洞穴可以很緊密地結(jié)合配體小分子，因此很容易理解這類BSA-配體絡(luò)合物的絡(luò)合常數(shù)K非常大[10～12]。這類絡(luò)合物的絡(luò)合常數(shù)K通常在1×105～1×106L·mol-1范圍，可以肯定屬于慢交換類型。然而，正與作者前面所提到的那樣，本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)不到這種類型的相互作用。本實(shí)驗(yàn)中采用很高的配體-蛋白濃度比，從而確保了BSA分子上的高親合力結(jié)合中心完全飽和。雖然實(shí)驗(yàn)體系中高親合力相互作用和低親合力相互作用同時(shí)存在，但本實(shí)驗(yàn)僅能獲得低親合力相互作用的信息。

作為生物大分子，不僅牛血清白蛋白可以和小分子配體發(fā)生作用，DNA、RNA或者酶都可以發(fā)生這種作用?？梢灶A(yù)料，Langmuir吸附等溫方程在配體-生物大分子研究中的應(yīng)用有著非常廣闊的前景。

3 結(jié)論

采用核磁共振馳豫測(cè)量研究了膽紅素和牛血清白蛋白間的低親合力相互作用。得到BR-BSA絡(luò)合物的表觀絡(luò)合常數(shù)K=36.0 L·mol-1，BSA分子上的最大結(jié)合中心數(shù)目n=98。顯然，研究配體-蛋白絡(luò)合物的結(jié)合等溫線是理解該類絡(luò)合物形成過(guò)程的關(guān)鍵。作為描述小分子在固體表面吸附和脫附動(dòng)力學(xué)平衡的一種手段，Langmuir吸附等溫方程能夠很好地解釋生物大分子對(duì)小分子配體的低親合性結(jié)合能力。

參考文獻(xiàn)：

[1] Roberts G C K.NMR Spectroscopy in structure-based drug design[J].Curr Opin Biotechnol,1999,10(1):42-47.

[2] Campbell I D,Dwek R A.Biological Spectroscopy[M].Canada,Menlo Park:Benjamin/ Cummings Publishing Co,1984：97-98.

[3] Dwek R A.Nuclear Magnetic Resonance in Biochemistry[M].Oxford:Clarendon Press,1973：37-47.

[4] James T L.Nuclear Magnetic Resonance in Biochemistry[M].New York:Academic Press,1975：48-50.

[5] Ni F.Recent developments in transferred NOE methods[J].Progress in NMR Spectroscopy,1994,26:517-606.

[6] Atkins P W.Physical Chemistry(3rd ed)[M].Oxford:Oxford University Press,1986:762-789.

[7] Adamson A W,Gast A P.Physical Chemistry of Surfaces(6th ed)[M].New York:John Wiley & Sons,1997：368-369.

[8] Noctor T A G,Wainer I W.The use of displacement chromatography to alter retention and enantioselectivity on a human serum albumin-based HPLC chiral stationary phase:A mini-review[J].Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies,1993,16(4):783-800.

[9] Kohita H,Matsushita Y,Moriguchi I.Binding of carprofen to human and bovine serum albumins[J].Chem Pharm Bull,1994,42(4):937-940.

[10] Rahman M H,Maruyama T,Okada T,et al.Study of interaction of carprofen and its enantiomers with human serum albumin.Ⅱ.Stereoselective site-to-site displacement of carprofen by ibuprofen[J].Biochem Pharmacol,1993,46(10):1733-1740.

[11] Hage D S,Noctor T A G,Wainer I W.Characterization of the protein binding of chiral drugs by high-performance affinity chromatography.Interactions ofR-andS-ibuprofen with human serum albumin[J].J Chromatogr A,1995,693(1):23-32.

[12] Epps D E,Raub T J,Kézdy F J.A general,wide-rage spectrofluorometric method for measuring the site-specific affinities of drugs toward human serum albumin[J].Anal Biochem,1995,227(2):342-350.