肖 錦 王光忠 劉焱文

湖北中醫(yī)藥大學(xué)（430063）

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thumb.）Breit.的干燥塊莖，其味辛，有毒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效[1]。產(chǎn)于湖北荊門地區(qū)的荊半夏為道地藥材，野生植物資源較豐富，多為夏秋二季采挖[2]。諸多文獻(xiàn)報(bào)道，半夏主要活性成分為生物堿、有機(jī)酸等類型的化合物，并將鳥嘌呤核苷作為含量測(cè)定指標(biāo)控制該藥材質(zhì)量[3,4]。次黃嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷是核苷酸的代謝產(chǎn)物，也是形成嘌呤堿的重要原料，是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性[5]。本文采用RP-HPLC分析方法，對(duì)夏秋兩季采收荊半夏中鳥嘌呤核苷和次黃嘌呤核苷的含量進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明夏季采收荊半夏有效成分含量較高，可望為該中藥最佳采收季節(jié)提供一定參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AgiLent 1100 series 高效液相色譜儀（G1322A排氣閥，G1311A泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測(cè)器，AgiLent色譜工作站）；HypersiL C18色譜柱；十萬分之一天平（Sartorius BP211D）；萬分之一天平（Metter toLedo AL204）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為40kHz）。

1.2 藥材與試劑

藥材：荊半夏生藥材采自于湖北省荊門地區(qū)（夏季荊半夏采于2009年5月，秋季荊半夏采于2009年10月）。經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張秀橋副教授鑒定為半夏Pinellia ternata（Thumb.）Breit.的干燥塊莖。

試劑：鳥嘌呤核苷（含量＞99%）、次黃嘌呤核苷（含量＞99%）均購(gòu)自Sigma—ALdrich公司；甲醇（分析純，上海振興化工一廠）；磷酸（分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠），雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取鳥嘌呤核苷4.8mg、次黃嘌呤核苷4.5mg，置25mL量瓶中，加水溶解并定溶至刻度，搖勻；精密量取0.2mL，置于5mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（每mL含有鳥嘌呤核苷7.68μg、次黃嘌呤核苷7.2μg）。

2.1.2 供試品溶液的制備

取半夏藥材粉末（60目）約1g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加水50mL，密塞，超聲提取30min后，精密吸取上清液25mL，水浴濃縮至適量，用水溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，以0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液[3]。

2.2 色譜條件

色譜柱為HypersiL C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相見表1；流速0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)λ=254nm；柱溫30℃。

表1 流動(dòng)相梯度

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取該溶液10μL，注入高效液相色譜儀，鳥嘌呤核苷和次黃嘌呤核苷的保留時(shí)間分別為19.640min和11.149min。理論塔板數(shù)以次黃嘌呤核苷計(jì)不低于9000，鳥嘌呤核苷和次黃嘌呤核苷與相鄰未知色譜峰分離度均＞1.5，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖（圖中1為次黃嘌呤核苷，2為鳥嘌呤核苷）

2.4 線性關(guān)系的考察

按對(duì)照品溶液的制備項(xiàng)下操作，得混合對(duì)照品溶液。精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL，分別置5mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取上述不同濃度混合對(duì)照品溶液10μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程。結(jié)果：鳥嘌呤核苷的回歸方程為：Y=48.038X+14.27，相關(guān)系數(shù)：r=0.9999，在3.84～30.72μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；次黃嘌呤核苷的回歸方程為Y=38.31X+366.13，相關(guān)系數(shù)：r=0.9999，在3.6～28.8μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰而積計(jì)算RSD（%），鳥嘌呤核苷和次黃嘌呤核苷峰面積的RSD分別為1.23%和1.17%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取夏季荊半夏樣品（粉碎過60目篩）6份，按照2.1.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果夏季荊半夏中鳥嘌呤核苷平均含量為219.05μg/g（RSD=0.12%），次黃嘌呤核苷的含量為82.25μg/g（RSD=0.33%），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取夏季荊半夏藥材（過60目篩），按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10h進(jìn)樣10μL，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果鳥嘌呤核苷的RSD=0.13%；次黃嘌呤核苷的RSD=0.50%，表明供試品溶液在10h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知鳥嘌呤核苷和次黃嘌呤核苷含量荊半夏樣品約0.5g，共9份，精密稱定，分別按鳥嘌呤核苷和次黃嘌呤核苷含量的80%，100%，120%加入對(duì)照品溶液，每個(gè)平行3份，按供試品溶液的制備方法制成加樣回收供試品液。取10μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果鳥嘌呤核苷低、中、高3個(gè)加入量的回收率（n=3）分別為103.59%、103.63%、103.9%；RSD分別為2.66%、1.46%、1.55%；平均回收率（n=9）為103.71%；次黃嘌呤核苷低、中、高3個(gè)加入量的回收率（n=3）分別為97.75%、97.59%、99.23%;RSD分別為0.17%、0.36%、0.68%；平均回收率（n=9）為98.19%，表明該方法可靠性強(qiáng)。

2.9 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取不同產(chǎn)地，夏季、秋季采荊半夏藥材（粉碎，過60目）1g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試液。精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 半夏傳統(tǒng)采收時(shí)間是夏秋兩季，夏季（5～6月）即為農(nóng)歷“立夏”至“夏至”，秋季（9～10月）即為農(nóng)歷“秋分”至“霜降”。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，半夏的最佳采收時(shí)間為夏季6月和秋季9月，分別是農(nóng)歷的“芒種”至“夏至”和農(nóng)歷“秋分”前后。但是，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，夏季采收荊半夏藥材中鳥嘌呤核苷和次黃嘌呤核苷的含量均高于秋季采收的藥材，秋季采收荊半夏藥材中次黃嘌呤的含量甚微；而且夏季采收荊半夏藥材的性狀明顯優(yōu)于秋季采收藥材，其粒徑較大，色澤更白，質(zhì)地更為堅(jiān)實(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為荊半夏采收季節(jié)提供了參考依據(jù)。

3.2 本文制定的含量測(cè)定方法易于操作，分離度高，重現(xiàn)性良好，可靠性強(qiáng)，從而為荊半夏的質(zhì)量控制提供了一種簡(jiǎn)便易行的含量測(cè)定方法，可望作為再版中國(guó)藥典收訂時(shí)的參考依據(jù)。

[1] 中國(guó)藥典.一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 龔千鋒,丁安偉,孫秀梅,等.中藥炮制學(xué)[M]. 北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2003:324-330.

[3] 張科衛(wèi),吳皓,崔小兵,等.不同產(chǎn)區(qū)半夏藥材中鳥苷含量的測(cè)定[J].中成藥,2000,22(11):769.

[4] 鹿野美弘,有元良幟子,趙昌代,等.小半夏加茯苓湯ぉけゐ[半夏]の指標(biāo)物質(zhì)[J].生藥學(xué)雜志,1987,41(4):282.

[5] Kinahan JJ,KowaL EP,Grindey GB. BiochemicaL and antitumor effects of the combination of thymidine and 1-β-D-arabinofuranosyLcy-tosine against eukemia L1210[J]. Cancer Res,1981,41(2):445.

[6] 白權(quán),李敏.半夏采收加工標(biāo)準(zhǔn)探討[J].中國(guó)藥師,2006,9(5):417-419.