吳勁松,馮曉博,盧月梅,吳偉元,李文青

新生和格特隱球菌是導(dǎo)致人類和動物發(fā)生致命感染的病原真菌。其中,新生隱球菌主要感染免疫抑制患者,而格特隱球菌可感染免疫正常人群。新生和格特隱球菌是一種擔(dān)子菌酵母,在臨床中多以酵母相存在。該菌具有異宗配合的有性生活周期,其交配體系存在 α和 a兩種相對的交配型,即MATα和MATa。交配型α和 a發(fā)生交配后,將產(chǎn)生重組的擔(dān)子孢子。研究發(fā)現(xiàn),擔(dān)子孢子比酵母細(xì)胞具有更強(qiáng)的感染能力〔1〕。與酵母形態(tài)的隱球菌相比,擔(dān)子孢子被認(rèn)為更可能是經(jīng)呼吸道導(dǎo)致感染發(fā)生的起始致病因子〔2〕。因此,α和a交配型的準(zhǔn)確鑒定及后續(xù)研究將有利于闡明新生和格特隱球菌的遺傳學(xué)、生物學(xué)和致病性特征。

基因分型結(jié)果表明,根據(jù)一定的遺傳差異,新生和格特隱球菌各分為VNI-VNIV和VGI-VGIV 8種主要基因型;不同的主要基因型具有不同的地理分布和致病特性〔3〕。目前,交配型的鑒定主要包括PCR特異擴(kuò)增分型和交配試驗(yàn)〔4〕。由于在大部分研究中分離的a交配型菌株較少,使得設(shè)計一種可通用于快速鑒定所有主要基因型a交配型的PCR方法及評價現(xiàn)有的鑒定a交配型的方法在各主要基因型中的通用性均顯得非常重要。本文通過設(shè)計針對a交配型位點(diǎn)內(nèi)特有的SXI2a基因的特異擴(kuò)增法,并和現(xiàn)有的針對STE20a、MFa或 ST E3a基因的特異擴(kuò)增法及交配試驗(yàn)進(jìn)行比較,評價其在鑒定新生和格特隱球菌各主要基因型 a交配型中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株新生隱球菌MATa菌株,VNI基因型(3株)、VNIII基因型(6株,包括a/α和α/a各 3株)、VNIV基因型(4株);格特隱球菌MATa菌株,VGI基因型(5株)、VGII基因型(2株)、VGIII基因型(4株)、VGIV/IGS5b基因型(1株);新生和格特隱球菌MATα參考株,VNI-VGIV基因型各1株。所有受試新生和格特隱球菌菌株由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科真菌實(shí)驗(yàn)室保存。菌株資料見表1(注:VNII基因型至今未報道MATa菌株)。

1.2 試劑 培養(yǎng)基原料購自Sigma、Campbell和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Taq酶、PCR相關(guān)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 基因組提取 受試菌株于YPD斜面培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2d后,取一環(huán)菌接于無菌蒸餾水,離心取沉淀,后續(xù)步驟參照Meyer等的DNA提取方法〔3〕。

1.4 引物設(shè)計 檢索GenBank中所有SXI2a基因的等位序列結(jié)果如下,125.91(VNI,MATa,AF542528)、JEC20(VNIV,MATa,AF542530)、E566(VGI,MATa,AY710429)、SXI2a_1(VGI,AY973652)、SXI2a_2(VGI,AY973653),SXI2a_3(VGI,AY973654),SXI2a_4(VGIII,DQ096310),SXI2a_5(VGII,DQ198316),采用 ClustalW2軟件進(jìn)行序列比對,在SXI2a基因最長的4號外顯子的保守序列上設(shè)計通用引物(圖1),經(jīng)篩選后選擇引物SXI2aF(5'-ACGAGTGCCTCCACCATATCA-3')-SXI2aR(5'-ACGGGTACAGT TT TGA GCTGG-3')進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 SXI2a基因結(jié)構(gòu)模式圖和SXI2aF-SXI2aR引物擴(kuò)增區(qū)域Fig.1 Schematic representation of SXI2a gene and the amplified region by primer pair SXI2aF-SXI2aR

1.5 各主要基因型的交配型鑒定 分別采用基于MATa 位點(diǎn)內(nèi) SXI2a、STE20a、STE3a、MFa 基因的引 物 SXI2aF-SXI2aR、STE20aF(5'-ATCCGCCCTCGA GTCAAA-3')-STE20aR(5'-TGGCGACCGACTGTAGAT-3')、STE3aF(5'-A CCT TTGCGGTT TCATCAAC-3')-STE3aR(5'-AAGGTCGCATGGGTAATGAG-3')、MFaF(5'-CGCCTTCACTGCTACCTTCT-3')-MFaR(5'-AACGCA AGAGTA AGTCGGGC-3')對受試菌株的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物SXI2aF-SXI2aR的PCR反應(yīng)條件為95℃5min;95℃30s,57℃30s,72℃50s,32個循環(huán);72℃6min。余引物擴(kuò)增條件見文獻(xiàn)〔4-6〕。根據(jù)是否擴(kuò)增出目的條帶來鑒定交配型。

1.6 交配試驗(yàn) 將受試株和交配型標(biāo)準(zhǔn)株分別接種于YPD斜面培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)48h后,取等量分別與交配型標(biāo)準(zhǔn)株NIH312(MATα)、B4546(MATa)、JEC21(MATα)、JEC20(MATa)混合后,接種于V8蔬菜汁培養(yǎng)基(5%V8蔬菜汁,0.5g/L KH2PO4,4%瓊脂)。培養(yǎng)全程在黑暗中進(jìn)行,保持相對干燥,25℃培養(yǎng)2周。肉眼觀察菌絲的產(chǎn)生,顯微鏡下觀察菌絲、擔(dān)子和擔(dān)子孢子的形成。

2 結(jié) 果

2.1 基于SXI2a基因的引物SXI2aF-SXI2aR擴(kuò)增各主要基因型a交配型的新生和格特隱球菌受試株均獲得750bp左右的目的片段(圖2);基于STE20a基因的引物ST E20aF-STE20aR除無法擴(kuò)增VGIV/IGS5b基因型的a交配型外,其余主要基因型菌株的 a交配型均擴(kuò)增得到目的片段;基于STE3a基因的引物STE3aF-STE3aR無法擴(kuò)增VGI、VGII、VGIV基因型的a交配型,其余主要基因型菌株的a交配型擴(kuò)增得到目的片段;基于MFa基因的引物MFaF-MFaR無法擴(kuò)增VNI、VNIIIa/α、VGI、VGII、VGIII、VGIV 基因型的 a 交配型,其余主要基因型菌株的a交配型擴(kuò)增得到目的片段。受 試 的 SXI2aF-SXI2aR、STE20aF-STE20aR、STE3aF-STE3aR、MFaF-MFaR 4對引物均無法擴(kuò)增所有主要基因型α交配型參考株(見表1)。

2.2 在交配試驗(yàn)中,均不能與α或a交配型標(biāo)準(zhǔn)株發(fā)生交配的a交配型菌株包括VGI(5株),其余a交配型受試株(VNIII除外)均能與α交配型標(biāo)準(zhǔn)株發(fā)生交配,而不能與a交配型標(biāo)準(zhǔn)株發(fā)生交配(結(jié)果見表1)。

表1 本文受試隱球菌菌株、交配型特異擴(kuò)增和交配試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The cryptococcal strains tested,and the results of specific amplification and mating assay

3 討 論

新生和格特隱球菌在自然界中存在無性克隆和有性交配兩種主要的繁殖方式。其生活周期中包括有異宗配合、雌雄異株的有性階段,其交配型位點(diǎn)包括兩種不同的等位基因,即α和a,有著相對交配型的酵母細(xì)胞在適當(dāng)環(huán)境下發(fā)生交配,產(chǎn)生重組的擔(dān)子孢子。擔(dān)子孢子被認(rèn)為很可能是經(jīng)呼吸道導(dǎo)致感染發(fā)生的致病因子。新生和格特隱球菌有性交配后產(chǎn)生的擔(dān)子孢子具有直徑小、易播散和抗干燥能力強(qiáng)等特點(diǎn),易進(jìn)入并沉積于肺泡。動物實(shí)驗(yàn)表明,小鼠吸入少量的擔(dān)子孢子即可導(dǎo)致隱球菌病,而吸入更大量的親本酵母細(xì)胞,卻不能導(dǎo)致感染〔1-2〕。

盡管目前臨床和環(huán)境中分離的隱球菌菌株多為α交配型,但有研究表明少數(shù)地區(qū)的環(huán)境分離株中存在一定比例的a交配型菌株,并通過遺傳學(xué)分析證實(shí)環(huán)境株中存在重組現(xiàn)象〔4,7〕,提示這種致病酵母在一定的生態(tài)環(huán)境中完成交配產(chǎn)生子代。實(shí)驗(yàn)研究表明,酵母經(jīng)有性繁殖后產(chǎn)生的子代比無性克隆的子代具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,對1999年至今在加拿大溫哥華島上持續(xù)流行的隱球菌病的調(diào)查顯示,主要致病菌為交配后產(chǎn)生的子代。然而,這種流行于地處溫帶溫哥華島的致病真菌卻是原本分布于熱帶和亞熱帶的格特隱球菌。證明該流行與有性繁殖后產(chǎn)生的重組子代具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力及毒力變異有關(guān)〔8〕。

圖2 SXI2aF-SXI2aR引物擴(kuò)增各主要基因型a交配型和α交配型參考株部分結(jié)果M,Marker;1-14 依 次 為:KN99、JEC20、E566、WM628、CBS1930、B4546、RV63979、H99、JEC21、WM179、WM178、WM161、WM779、陰性對照Fig.2 The partial results of amplification of MAT αand MATa reference strains within different genotypes with primers SXI2aF and SXI2aR.From left to right:M arker,KN99,JEC20,E566,WM628, CBS1930, B4546, RV63979, H99,JEC21,WM179,WM178,WM161,WM779,negative control

新生和格特隱球菌從遺傳學(xué)上可分為 8種主要基因型;各主要基因型的交配型位點(diǎn)內(nèi)基因序列存在明顯差異,而同一主要基因型菌株間序列相似性極高(＞99%)〔4〕;另外,由于目前研究中分離的a交配型菌株較少,使得設(shè)計和評價PCR特異擴(kuò)增法在鑒定不同主要基因型a交配型菌株中的作用尤為重要。本文通過設(shè)計針對a交配型位點(diǎn)內(nèi)特有的SXI2a基因(α位點(diǎn)無此基因)的特異擴(kuò)增法,通過和文獻(xiàn)報道的針對STE20a、MFa或STE3a基因的特異擴(kuò)增法及交配試驗(yàn)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,引物SXI2aF-SXI2aR擴(kuò)增受試的所有主要基因型a交配型菌株均獲得目的片段,而另外3對引物均不能完全擴(kuò)增所有主要基因型的a交配型。通過與文獻(xiàn)采用的3對a交配型特異性引物進(jìn)行比較得出,SXI2aF-SXI2aR在鑒定所有類型的a交配型菌株中具有更好的通用性;同時,該引物無法擴(kuò)增受試的所有主要基因型α交配型參考株,表明該引物是a交配型的特異擴(kuò)增引物。和文獻(xiàn)報道一致〔7〕,本文受試株中也存在不育株,通過交配試驗(yàn)無法鑒定其交配型,且交配試驗(yàn)耗時久,故其鑒定作用受到限制。綜上所述,本文針對SXI2a基因的PCR擴(kuò)增可鑒定新生和格特隱球菌各主要基因型的 a交配型。SXI2aF-SXI2aR引物在快速鑒定a交配型中具有更好的通用性。

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