張馨琢,黃永茂,陳 莊,鐘 利,陳 楓,游春芳,鄧 敏

國內(nèi)各地近年來報(bào)道大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)對(duì)環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)的耐藥率已超過50%,并且這些耐CIP菌株對(duì)氨基糖苷類藥物(aminoglycosides,AGs)的耐藥形勢(shì)逐漸嚴(yán)峻,其耐藥機(jī)制最重要的是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶,此類酶作用于藥物特定的氨基或羥基,使藥物鈍化,使其降低或喪失對(duì)靶位核糖體的親和力,使細(xì)菌在藥物存在的情況下仍能存活。為此本文對(duì)臨床分離的耐CIP大腸埃希菌對(duì)AGs藥物的耐藥表型和基因型進(jìn)行了相關(guān)分析,為臨床合理選用AGs藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 分離自本院 2007年 7月至2008年7月非腸道感染的住院病例大腸埃希菌75株(不含同一病人同一部位感染的重復(fù)菌株),經(jīng)MicroScan WalkAway-40型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定。大腸埃希菌質(zhì)控株ATCC 25922購自國家臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑 環(huán)丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星紙片均購自杭州天和微生物試劑公司;M-H培養(yǎng)基、胰大豆蛋白胨肉湯購自英國Oxiod公司;LB液體培養(yǎng)基購自上海生工生物技術(shù)公司;Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司;2×Taq PCR MasterMix試劑盒、電泳瓊脂糖購自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗(yàn) 按NCCLS推薦的紙片擴(kuò)散法(Kerby-Bauer法)測(cè)定75株大腸埃希菌對(duì)環(huán)丙沙星(CIP)的耐藥率,把菌株分為耐CIP組與非耐CIP組。K-B法測(cè)定2組菌株對(duì)6種AGs(鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星)的耐藥性。以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。結(jié)果判讀參照NCCLS2006常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 氨基糖苷類修飾酶(AMEs)基因檢測(cè) 用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取大腸埃希菌臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922的基因組DNA,操作步驟按照說明書進(jìn)行。參考文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì)6對(duì)引物,由上海生工生物技術(shù)公司合成,見表1。PCR反應(yīng)采用2×Taq PCR MasterMix試劑盒,按說明書進(jìn)行操作。6種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為:每反應(yīng)體系加入 P1、P2引物各 10μ mol/L,dNTP each 6.25μ mol/L,KCl 1 250μ mol/L,MgC12 37.5μ mol/L,Tris-HCl(pH8.3)250μ mol/L,Taq Polymerase 1.25U,總反應(yīng)體積 25μL,其中模板液5μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性 3min,94℃變性30 s,55℃退火 30s,72℃延伸30s,共 30個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳80V 50min,以DNA 100-600bp ladder Marker為分子量標(biāo)記,電泳后用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物的大小并貯存結(jié)果。收集到DNA溶液(未純化)用核酸定量?jī)x測(cè)得濃度＞390ng/μL,送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行基因測(cè)序。

表1 6種氨基糖苷類修飾酶基因引物序列Table 1 The primers'sequeses of six aminoglycosides modifing enzymes genes

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn),比較耐CIP組與非耐CIP組之間對(duì)氨基糖苷類的耐藥表型和基因型有無差別。α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 75株大腸埃希菌中,53株(70.67%)對(duì)CIP耐藥。耐CIP組對(duì)慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素的耐藥率較高:73.58%、64.15%、62.26%,對(duì)慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素的耐藥率與非耐CIP組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),耐CIP組與非耐CIP組對(duì)6種AGs耐藥率的比較詳見表2。耐CIP組以多重耐藥表型常見,且比例明顯高于非耐CIP組(P=0.001),而非耐CIP組全敏感表型所占比例與耐CIP組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002),耐CIP組與非耐CIP組對(duì)6種AGs耐藥表型的比較詳見表3。耐CIP組對(duì)AGs的多重耐藥表型復(fù)雜:16株(30.19%)對(duì)3種AGs耐藥,7株(13.21%)對(duì)5種AGs耐藥;而非耐CIP組僅3株表現(xiàn)為多重耐藥。

2.2 氨基糖苷類修飾酶基因檢測(cè)結(jié)果 耐CIP組AMEs基因的總檢出率為 77.36%,其中 30株(56.60%)檢出aac(3)-II,22株(41.51%)檢出 aac(6′)-I。22株非耐 CIP菌株 AMEs基因的總檢出率為59.09%,其中 aac(3)-II、ant(3〞)-I的檢出率較高。aac(6′)-I的檢出率,耐CIP組明顯高于非耐CIP組(P=0.006);其余5種基因檢出率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。耐CIP組與非耐CIP組AMEs基因檢出率的比較詳見表4、圖1。單基因型、雙基因型、三基因型的檢出率在耐CIP組與非耐CIP組中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表5。耐CIP組中,對(duì)應(yīng)6種AGs的耐藥表型,aac(3)-II在全敏、單耐藥、雙耐藥、多重耐藥中的檢出率分別為:33.33%、50%、45.45%、62.50%;aac(6′)-I在對(duì)AGs的全敏、單耐藥、雙耐藥、多重耐藥表型中的檢出率分別為:0、0、27.27%、59.38%;ant(2〞)-I在對(duì)AGs的(全敏+單耐藥+雙耐藥)表型中的檢出率為9.09%,在多重耐藥表型中的檢出率為9.38%;ant(3〞)-I在對(duì)AGs的(全敏+單耐藥+雙耐藥)表型中的檢出率為9.09%,在多重耐藥表型中的檢出率為21.88%。由此可見,隨著耐CIP菌株對(duì)AGs耐藥種類的增加,AMEs基因的檢出率也逐漸增高,以aac(3)-II、aac(6′)-I最為明顯,并且對(duì)AGs多重耐藥的菌株常常檢出多個(gè)AMEs基因;而非耐CIP菌株耐藥表型與基因型的關(guān)系未呈現(xiàn)此現(xiàn)象。各組PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測(cè)序后證實(shí)是E.coli的 aac(3)-II、aac(6′)-I、ant(3 〞)-I、ant(2〞)-I、aac(3)-I基因序列。

表2 耐CIP與非耐CIP菌株AGs耐藥率的比較Table 2 Drug resistant differences between ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains to aminoglycoside antibiotics

表3 耐 CIP與非耐CIP菌株AGs表型的比較Table 3 Difference of drug-resistant phenotypes between ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains to aminoglycoside antibiotics

表4 耐CIP與非耐CIP菌株AMEs基因型的比較Table 4 Difference of AMEs genetypesbetween ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains

表5 耐CIP與非耐CIP菌株 AMEs基因型比較Table 5 Difference of AMEs genetypesbetween ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains

圖1 PCR電泳圖譜Fig.1 Electrophoregram of PCR

3 討 論

大腸埃希菌是臨床上細(xì)菌感染常見病原菌之一。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重,給臨床抗感染治療的抗生素選擇增加了難度。本地區(qū)耐CIP的臨床分離株對(duì)慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素的耐藥率比非耐CIP菌株有明顯增高(P＜0.05),且對(duì)AGs的耐藥表型復(fù)雜,其中多重耐藥表型占56.60%,明顯高于非耐CIP菌株(P＜0.05);而非耐CIP菌株則以全敏感、單耐藥表型較為多見。耐CIP菌株對(duì)大部分AGs的耐藥率增高,且容易發(fā)生對(duì)AGs的多重耐藥,這可能與耐CIP菌株同時(shí)攜帶多種耐藥基因有關(guān)〔2-5〕。

耐CIP菌株對(duì)慶大霉素(73.58%)、卡那霉素(64.15%)、鏈霉素(62.26%)的耐藥率較高,并且對(duì)AGs藥物出現(xiàn)了較高的交叉耐藥率。其耐藥機(jī)制復(fù)雜,其中最重要的機(jī)制是產(chǎn)AMEs。目前從美國GenBank核酸庫已能檢索到AMEs 30多種基因型,但在大腸埃希菌中以 aac(3)-II、aac(6′)-I、ant(3〞)-I等基因型為常見。本文AMEs基因檢測(cè)結(jié)果具有相似的結(jié)果:耐CIP菌株AMEs基因的總檢出率為 77.36%,其中 aac(3)-II為 56.60%,aac(6′)-I為 43.40%,耐 CIP 菌株 aac(6′)-I的檢出率明顯高于非耐CIP菌株(P=0.006)。本文發(fā)現(xiàn)一株耐CIP菌株(標(biāo)本號(hào)20060)的基因擴(kuò)增序列與GenBank gb|DQ303918.1|大腸埃希菌氟喹諾酮乙酰化氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac(6')-Ib-cr的核苷酸序列相匹配,與文獻(xiàn)報(bào)道相似〔6〕。aac(6')-Ib-cr是aac(6')-Ib-cr的一種變異體,兩處堿基的突變賦予了其修飾喹諾酮類的特性。AAC(6')-Ib-cr不僅可以修飾氨基糖苷類藥物,對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物也具有乙?；揎椬饔谩?-9〕。

耐CIP菌株多表現(xiàn)為多基因型和多重耐藥表型,且兩者關(guān)系較為復(fù)雜,耐藥表型和AMEs基因檢測(cè)結(jié)果未能達(dá)到一一對(duì)應(yīng);而非耐CIP菌株則以單基因型和單耐藥表型多見。AMEs在細(xì)菌體內(nèi)的實(shí)際表達(dá)量以及細(xì)菌對(duì)藥物的攝入和水解速度都可能影響分離菌最終的耐藥表型〔10〕。

綜上所述,本地區(qū)耐CIP大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類藥物的交叉耐藥情況較為常見,耐CIP菌株多表現(xiàn)為同時(shí)對(duì)多種氨基糖苷類藥物耐藥。耐CIP大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥與氨基糖苷類修飾酶存在一定相關(guān)性,以AAC(6′)-I最為明顯。

〔1〕糜祖煌,陸亞華,黃支密,等.PCR檢測(cè)氨基糖苷類修飾酶基因〔J〕.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2005,25(2):160.

〔2〕Li XZ.Quinolone resistance in bacteria:emphasis on plasmidmediated mechanisms〔J〕.Int J Antimicrob Agents,2005,25(6):453-463.

〔3〕Luzzaro F.Fluoroquinolones and Gram-negative bacteria:antimicrobial activity and mechanisms of resistance〔J〕.Infez Med,2008,16 Suppl 2:5-11.

〔4〕Périchon B,Courvalin P,Galimand M.Transferable resistance to aminoglycosides by methy lation of G1405 in 16S rRNA and to hydrophilic fluoroquinolones by QepA-mediated efflux in Escherichia coli〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2007,51(7):2464-2469.

〔5〕Périchon B,Bogaerts P,Lambert T,et al.Sequence of conjugative plasmid pIP1206 mediating resistance to aminoglycosides by 16S rRNA methylation and to hydrophilic fluoroquinolones by efflux 〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2008,52(7):2581-2592.

〔6〕Yang H,Chen H,Yang Q,et al.High prevalence of plasmidmediated quinolone resistance genes qnr and aac(6ˊ)-Ib-cr in clinical isolates of Enterobacteriaceae from nine teaching hospitals in China〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2008,52(12):4268-4273.

〔7〕Park C H,Robicsek A,Jacoby G A,et al.Prevalence in the United States of aac(6')-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme 〔J〕.Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50:3953-3955.

〔8〕Morgan-Linnell SK,Becnel Boyd L,Steffen D,et al.Mechanisms accounting for fluoroquinolone resistance in Escherichia coli clinical isolates〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2009,53(1):235-241.

〔9〕Vetting MW,Park CH,Hegde SS,et al.Mechanistic and structural analysis of aminoglycoside N-acetyltransferase AAC(6')-Ib and its bifunctional,fluoroquinolone-active AAC(6')-Ib-cr variant〔J〕.Biochemistry,2008,47(37):9825-9835.

〔10〕Jakoniuk P,Wieczorek P,Sacha PT,et al.T he role of aminoglycoside-modifying enzymes in resistance of G ram-negative rods〔J〕.Med Dosw Mikrobiol,2006,58(4):363-370.