王 喜,賀 鵬,劉玉彩,吳 芳,王 萍,章 樂,張萬江

結(jié)核病目前仍然是威脅人類三大感染性疾病之一,全球約1/3人口感染結(jié)核分枝桿菌。但是,在感染人群中僅1/10發(fā)病,提示個體差異可能與結(jié)核病易感性相關(guān)?，F(xiàn)代免疫學(xué)證實,T細胞受體-抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體構(gòu)成的三分子復(fù)合體是特異性細胞免疫應(yīng)答的分子基礎(chǔ)。HLA-Ⅱ類基因在抗原提呈和免疫應(yīng)答中起著重要作用,其某些變異的等位基因可能使人體對某些疾病產(chǎn)生易感性〔1〕。國外已有不少學(xué)者對此進行了研究并取得了令人振奮的成果。我國也有中國北方漢族部分人群肺結(jié)核發(fā)病與 HLA-DRB1*15等位基因密切相關(guān)〔2〕,中國南方漢族部分人群肺結(jié)核發(fā)病與DR16等位基因密切相關(guān)的報道〔3〕。但有關(guān)HLA-DRB1等位基因與中國新疆維吾爾族人群結(jié)核病易感性的相關(guān)性研究未見報道。由于HLA等位基因在不同種族、不同地域的人群中有很大的差異,因此對不同種族、不同地域的結(jié)核病患者與HLA基因的相關(guān)性進行研究其意義將更加重大。我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(polymerase chain reactionsequence specific primers,PCR-SSP)技術(shù)對226例新疆維吾爾族肺結(jié)核病患者和231例新疆維吾爾族健康對照者進行HLA-DRB1基因分型并比較其基因頻率(GF),探討HLA-DRB1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族人群結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 肺結(jié)核病例組 新疆阿克蘇地區(qū)長期生活的維吾爾族結(jié)核病患者226例,其中男115例、女111例,年齡18～68歲。病例按照國家制定的肺結(jié)核診斷標準〔4〕診斷。

1.1.2 健康對照組 新疆阿克蘇地區(qū)長期生活的維吾爾族正常人231名,其中男118名、女113名,年齡20～70歲。

1.2 主要試劑及儀器 Tap DNA聚合酶(北京天根生物公司)、蛋白酶 K(德國Merck公司)、引物(北京三博遠志生物公司)、dNTP(北京天根生物公司)。T-GRADIENT PCR儀(Bio-RAD,USA),微量凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-RAD,USA),紫外光分析系統(tǒng)(Bio-RAD,USA)。

1.3 試驗方法

1.3.1 外周血白細胞基因組DNA提取 取抗凝血加入2倍體積的淋巴細胞分離液,用水平離心機以1 500 r/min離心 30min收集白細胞,之后用PBS洗滌2遍。用酚氯仿法提取白細胞中的 DNA〔5〕。

1.3.2 DNA純度測定 取DNA樣本少許,用紫外分光光度計測定其在波長230、260、280nm處的吸光度值。若OD260/OD280＞1.7,OD260/OD230＞2.0,則DNA純度合格,否則重新提取。

1.3.3 引物的設(shè)計與合成 序列特異性引物(SSP)共13對 ,參照Olerup 等〔6〕針對DRB1等位基因第二外顯子多態(tài)性設(shè)計的特異性堿基序列。陽性內(nèi)對照選取人生長激素基因,上游引物序列為:5'-GCCT TCCCAACCAT TCCCTTA-3',下游引物序列為:5'-TCACGGATT TCTGT TGTGT TTC-3',擴增片段長度為429bp。上述引物均由北京三博遠志生物公司合成。所擴增的13個DRB1等位基因名稱、擴增片段長度及其各引物序列見表1。

表1 HLA-DRB1基因PCR-SSP分型采用的各引物序列和產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences and sizes of PCR products used for HLA-DRB1 genotyping by PCR-SSP

1.3.4 特異性PCR擴增 每一個樣本DRB1位點同時進行13個獨立的PCR反應(yīng),每一個反應(yīng)管中均含有確定相應(yīng)位點等位基因型別的特異性引物和內(nèi)對照引物。PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 3μL,2.5mmol/L dNT P 4μL,10pmol/μL 的特異性引物各0.8μL,10pmol/μL的內(nèi)對照引物各0.3μL,50-100ng/μL 基因組 DNA 3μL,2.5U/μL Tap DNA 聚合酶0.8μL,用去離子水補足至25μL。擴增條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,60℃退火1min,72℃延伸 1min,共 30個循環(huán);72℃延伸5min。

1.3.5 PCR擴增結(jié)果檢測 取擴增產(chǎn)物5μL與上樣緩沖液 1μL混勻,用 2%的瓊脂糖凝膠電泳,100V,25min。電泳結(jié)束后于紫外成像儀上觀察結(jié)果并記錄。

1.3.6 DNA測序 對每一等位基因隨機抽取10%PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進行精確核酸序列檢測。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析 兩組各等位基因頻率的計算采用公式GF=1-(1-f)1/2,f為人群中某等位基因陽性個體的百分率。病例組與對照組等位基因分布的差異采用 χ2檢驗或Fisher's精確檢驗。用校正P值(Pcorrect,Pc值)以Pc＜0.05作為有顯著性差異的判斷標準,Pc值等于P值乘以實驗研究中所檢測到的等位基因個數(shù)。疾病與H LA-DRB1等位基因的相關(guān)性通過計算比值比 OR(odds ratio)和95%可信區(qū)間(95%confidence intervals,95%CI)來表示;統(tǒng)計分析由SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 HLA-DRB1基因特異性擴增結(jié)果 每個樣本DRB1位點同時進行13個獨立的PCR反應(yīng),每次PCR反應(yīng)的結(jié)果判斷必須在有內(nèi)對照引物擴增條帶出現(xiàn)的前提下進行。個體的H LA-DRB1基因型別直接由相應(yīng)特異性引物擴增條帶的出現(xiàn)確定。圖1為一例樣本PCR-SSP擴增產(chǎn)物電泳圖譜。

圖1 HLA-DRB1*04/07雜合體PCR-SSP擴增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of the amplified PCR-SSP products of HLA-DRB1*04/07 heterozygote

2.2 測序結(jié)果 對每一等位基因隨機抽取10%PCR擴增產(chǎn)物進行測序,測序結(jié)果利用NCBI中的BLAST軟件分析后,與參考序列同源性高達99%。

2.3 病例組和對照組 HLA-DRB1基因頻率檢測結(jié)果 PCR-SSP法擴增HLA-DRB1各等位基因在226例PTB病例組及231例正常對照組中的分布情況,詳見表2。在所檢測的13對等位基因中我們發(fā)現(xiàn):肺結(jié)核病例組中DRB1*11等位基因頻率顯著高于健康對照組,兩組的GF值分別為4.53%和1.09%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.872,OR=4.388,Pc=0.026＜0.05)。肺結(jié)核病例組中HLADRB1*04基因頻率顯著高于健康對照組,兩組的GF分別為12.77%和8.36%,但P值經(jīng)過校正后Pc＞0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 肺結(jié)核病例組與對照組的HLA-DRB1等位基因頻率比較Table 2 Comparision of the HLA-DRB1 alleles frequence of PTB patients and controls

3 討 論

隨著基因組流行病學(xué)的發(fā)展,宿主易感基因在結(jié)核病發(fā)生與發(fā)展中的作用日益受到人們的重視,越來越多的結(jié)核病候選易感基因被確認,通過關(guān)聯(lián)分析研究這些基因在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用已成為當(dāng)前該領(lǐng)域一個重要的研究方向。

H LA復(fù)合體遺傳區(qū)位于人類6號染色體短臂上,全長約4 000 kb含有約 4×106個堿基,約占人類基因組堿基數(shù)的0.1%。H LA復(fù)合體是迄今己知人體最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性和免疫多態(tài)性基因體系〔7〕現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有70余種疾病與 HLA基因多態(tài)性相關(guān)聯(lián),其中大多數(shù)自身免疫性疾病與HLA-II類基因相關(guān)。國內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病易感基因HLA-DRB1基因的多態(tài)性與結(jié)核病發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián),而且對于不同的人種和民族,研究結(jié)果不完全相同,有的結(jié)果還完全相反,因此推測結(jié)核病易感基因HLA-DRB1基因的多態(tài)性與結(jié)核病易感性有關(guān)聯(lián),而且可能存在明顯的種族差異性。

有關(guān)H LA-DRB1基因與肺結(jié)核病的關(guān)聯(lián)國內(nèi)外都有相關(guān)報道:伊朗人肺結(jié)核病與DRB1*07密切相關(guān)〔8〕,DRB1*0803與朝鮮人肺結(jié)核耐藥患者密切相關(guān)〔9〕,HLA-DRB1*13,*14等位基因與圖瓦地區(qū)肺結(jié)核病密切相關(guān)〔10〕,南非Venda地區(qū)肺結(jié)核病與DRB1*1302密切相關(guān),同時發(fā)現(xiàn)單倍型DRB1*1101-1121存在連鎖不平衡〔11〕,波蘭北部人群結(jié)核病與 DRB1*14、DRB1*16 相關(guān)〔12〕,墨西哥東北部肺結(jié)核病人與H LA-DR11(5),-DR16(2)緊密相關(guān),DR11(5)-DQ7(3),DR14(6)-DQS(1),DR16(2)-DQ7(3)單倍型在病例組中頻率較高;HLA-DR17(3),DQ8(3)等位基因及DR17(3)-DQ2,DR4-DQ8(3)單倍型在對照組中頻率較高〔13〕。

我們的研究結(jié)果顯示:新疆維吾爾族人群肺結(jié)核病例組中HLA-DRB1*11,等位基因頻率顯著高于健康對照組,提示新疆維吾爾族人群肺結(jié)核的發(fā)病可能與H LA-DRB1*11等位基因相關(guān)聯(lián)。這與我國先后報道北方漢族部分人群肺結(jié)核病易患性與DRB1*15密切相關(guān),南方漢族部分人群肺結(jié)核病的易感基因可能為DR16不相一致。這進一步證實了不同地域、不同種族的人群對結(jié)核分枝桿菌的易感性不同。

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