郭鵬娟,詹希美,甘 明,李卓雅,于彥杰,潘智華,張美春,何 藹

廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis,Ac)是引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎的重要病原體。幼蟲侵入人體,在體內(nèi)移行,最終侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起廣州管圓線蟲病〔1〕。該病主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū),近年來,隨著人們飲食生活習(xí)慣的改變,該病病例呈逐年增多趨勢,越來越引起人們的重視。WHO公布的21世紀(jì)新出現(xiàn)的全球威脅性傳染病中就包括廣州管圓線蟲病;我國衛(wèi)生部在2003年將其列為新發(fā)傳染病〔2-3〕。但目前關(guān)于該病的診斷、治療等研究仍較有限。天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease,ASP)是具有特征的一大類活性酶。研究證明,其在利什曼原蟲、盤尾絲蟲、血吸蟲及瘧原蟲等寄生蟲中,參與了重要的代謝過程,被認(rèn)為是較好的診斷分子及疫苗候選靶位〔4-5〕。本試驗采用PCR技術(shù)選擇性的擴(kuò)增ASP基因,并進(jìn)行了體外原核表達(dá),旨在為下一步利用重組蛋白研制廣州管圓線蟲病的診斷試劑盒及基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 血清 陽性病人血清為2006年夏季北京暴發(fā)期間臨床確診廣州管圓線蟲病病人血清。

1.1.2 菌株質(zhì)粒文庫 廣州管圓線蟲幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫由本室構(gòu)建。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)及大腸桿菌BL21/DE3系本室保種。

1.1.3 主要試劑和工具酶 dNTP、ExTaq酶、T4DNA連接酶、SacⅠ、KpnⅠ酶及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自TaKaRa公司。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自BBI;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自 Ferment公司。質(zhì)粒小提試劑盒購于Qiagen公司。采用U-gene DNA凝膠回收試劑盒。Ni-IDA Agarose購自美國Novagen公司。抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、DAB染色液均購自武漢博士德公司。

1.1.4 引物合成及質(zhì)粒DNA測序 特異性引物合成及重組質(zhì)粒DNA測序由大連寶生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 廣州管圓線蟲天冬氨酸蛋白酶基因的識別廣州管圓線蟲幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫(Library)系由本室與上海聯(lián)眾科技研究院合作構(gòu)建,經(jīng)文庫測序,對得到的大量Unigene基因進(jìn)行分析及歸并。其中的編號為0008e10的序列含有完整的開放讀碼框,編碼產(chǎn)物為廣州管圓線蟲的天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease,ASP)。

1.2.2 ASP基因的擴(kuò)增 根據(jù)已經(jīng)獲得ASP基因的編碼序列,利用DNAClub及Primer5.0設(shè)計特異性引物。上游引物 P1:為引入的K pnⅠ酶切位點;

以上述cDNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min,接著進(jìn)行94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸60s,反應(yīng)30個循環(huán),72℃延伸10min。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-(+)-ASP的構(gòu)建及鑒定 將目的基因及原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-(+)經(jīng)KpnⅠ、SacⅠ雙酶切后回收,連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 BL21/DE3,經(jīng)卡那霉素(Kana)篩選,陽性克隆進(jìn)一步通過PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.2.4 pET-30a-(+)-ASP基因在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取陽性單克隆菌落接種于5mL LB/kan(100μ g/L)液體培養(yǎng)基中,37℃,250 r/min振搖過夜培養(yǎng)12～16 h;將過夜培養(yǎng)物按照1∶100接種到LB/kan液體培養(yǎng)基中,37℃,250r/min培養(yǎng)2～3 h,至對數(shù)中期(OD=0.4-0.6);加入 IPTG至終濃度為1.0mmol/L,37℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)6 h,取1mL表達(dá)產(chǎn)物,13 000 r/min離心 1min,收集菌體。沉淀中加入100μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液,重懸。沸水浴煮沸 3～5min,13 000 r/min離心1min,取上清10μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 時間和溫度對融合表達(dá)的影響 按照1.2.4方法,分別在誘導(dǎo)時間為2h,4h,6h,8h,10h留樣,SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)時間對表達(dá)產(chǎn)物的影響;誘導(dǎo)溫度為25℃,30℃,37℃時,SDS-PAGE電泳分析溫度對表達(dá)產(chǎn)物量及可溶性的影響。

1.2.6 重組蛋白在大腸桿菌BL21中的大量誘導(dǎo)表達(dá)及親和層析純化 按照上述方法對陽性克隆進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),離心收集菌體,按菌液:裂解緩沖液 (含 20mmol/L Tris-Cl、500mmol/L NaCl、5mmol/L咪唑,pH 7.9)=25∶1的比例加入裂解緩沖液,重懸菌體。加入溶菌酶至終濃度1mg/mL,混勻,冰上放置30min;冰上超聲法裂解細(xì)菌:功率150W,超聲 1s,停 2s,總時間 12min。4℃,6 000g離心30min,取上清,經(jīng) 0.45μ m濾器過濾后,參照Ni-IDA Agarose說明書進(jìn)行親和層析純化。洗脫的目的蛋白經(jīng) PBS(pH7.4)4℃過夜透析,SDSPAGE電泳分析后備用。

1.2.7 免疫印跡法檢測重組蛋白 以抗His標(biāo)簽單克隆抗體(1∶1 000稀釋)及廣州管圓線蟲病人血清(1∶300稀釋)為一抗,山羊抗小鼠IgG-HRP溶液(1∶400稀釋)及羊抗人IgG-HRP為二抗,進(jìn)行免疫印跡實驗,分析鑒定蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 ASP基因的體外擴(kuò)增 PCR特異性擴(kuò)增目的基因,1.2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果顯示在大約360bp的位置有一個明顯的擴(kuò)增條帶,其大小與ASP基因編碼區(qū)長度一致,如圖1。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)過菌液PCR、質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定,通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳得到清晰的酶切圖象,目的基因在360bp的位置,載體基因在5 422bp位置,如圖2。

2.3 重組蛋白原核表達(dá)純化的SDS-PAGE分析經(jīng)鑒定含pET-ASP重組質(zhì)粒的BL21菌株,不同溫度下,IPTG終濃度1.0 mmol/L,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)過親和層析純化,經(jīng)15%SDS-PAGE鑒定,顯示在約16kD大小處有明顯的表達(dá)條帶(圖3),與理論分子量相符。蛋白純化效果較好。

2.4.1 重組蛋白的His-Tag鑒定 重組蛋白帶有6×his標(biāo)簽,通過與His單克隆抗體反應(yīng),可以發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的位置有條帶出現(xiàn),如圖4。

2.4.2 重組蛋白的廣州管圓線蟲病人血清鑒定重組蛋白識別廣州管圓線蟲病人血清,可以在相應(yīng)位置有反應(yīng)條帶出現(xiàn),如圖5。

3 討 論

天冬氨酸蛋白酶作為一種重要的活性酶,在脊椎動物中主要的天冬氨酸蛋白酶如,胃蛋白酶、組織蛋白酶D、E和腎素等都已經(jīng)確認(rèn)。這些酶參與降解和吞飲細(xì)胞內(nèi)蛋白,尤其是組織蛋白酶大多都與蛋白降解有關(guān),且組織分布廣泛。目前,天冬氨酸蛋白酶已經(jīng)在很多線蟲中得到確認(rèn),包括秀麗隱桿線蟲、美洲板口線蟲、犬鉤口線蟲及糞類圓線蟲等〔6-9〕。由天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶組成的腸源性多酶體系已被認(rèn)為是較好的線蟲疫苗候選抗原。有研究證明ASP在鉤蟲幼蟲侵入宿主過程中有重要作用,楊玉榮等對犬鉤蟲的ASP基因進(jìn)行了體外克隆,進(jìn)行了初步的研究,并推測認(rèn)為其在引起宿主的免疫反應(yīng)方面有重要作用,是抗鉤蟲疫苗的可能的候選分子〔10〕。在數(shù)種寄生蟲病中,天冬氨酸蛋白酶已經(jīng)是一些臨床用藥的靶位。

廣州管圓線蟲天冬氨酸蛋白酶的功能未知。本課題利用基因克隆和重組表達(dá)的方法將廣州管圓線蟲ASP基因進(jìn)行體外表達(dá),獲得純化的重組蛋白。免疫印跡(Western blotting)顯示該目的蛋白能被廣州管圓線蟲病人血清所識別。為進(jìn)一步研究該蛋白在廣州管圓線蟲中的作用奠定了基礎(chǔ)。

圖5 融合蛋白與廣州管圓線蟲病人血清的免疫印跡反應(yīng)Fig.5 Western blotting analysis of fusion protein with patients serum.

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