康金鳳,胡漢華,陳 蓉,武貴臻,杜同心,丁智慧,賀曉燕

棘球蚴寄生于人體所引起的疾病稱棘球蚴病或包蟲病。包蟲病是嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。包蟲病的治療,目前仍以手術(shù)治療為主。尋找有效的非手術(shù)的治療方法是我們的研究目標。細胞凋亡是細胞死亡的一種形式,是由外界因素觸發(fā)細胞內(nèi)部死亡機制,最終導(dǎo)致的細胞自身毀滅,在細胞毀滅的過程中,一般不伴有炎癥反應(yīng)〔1〕,是一種理想的殺蟲方式。有關(guān)寄生蟲學(xué)領(lǐng)域的細胞調(diào)亡,相關(guān)學(xué)者已在醫(yī)學(xué)原蟲、醫(yī)學(xué)蠕蟲方面做了一些研究〔2〕,但是目前尚未見棘球蚴內(nèi)原頭節(jié)自身產(chǎn)生細胞凋亡的報道。原頭節(jié)是棘球蚴的重要組成部分,并且在完成該蟲生活史中起著不可替代的作用;原頭節(jié)還在組織結(jié)構(gòu)上與棘球蚴有許多相同或相似之處〔3-4〕。本文觀察了棘球蚴內(nèi)原頭節(jié)自身是否存在細胞凋亡現(xiàn)象和探索了原頭節(jié)發(fā)生細胞凋亡的可能機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原頭節(jié) 采自新疆烏魯木齊屠宰場當日宰殺的新疆綿羊的肝臟或肺臟的細粒棘球蚴。將長有棘球蚴的臟器表面消毒后,分離、暴露出棘球蚴。用無菌注射器盡量吸出棘球蚴中囊液和游離的原頭節(jié)。手術(shù)摘除棘球蚴囊壁并在吸出的囊液中涮洗以收集殘留的原頭節(jié)和小育囊。備用。

1.1.2 試劑 兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)(編號為BS-0169R)、兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)(編號為 BS-0081R),美國ZYMED過氧化物酶標記鏈酶卵白素(SP)染色試劑盒,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒,均購自北京博奧森生物公司。TUNEL(原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記)細胞凋亡原位檢測試劑盒為凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 普通顯微鏡觀察 直接吸取采集出來的原頭節(jié)于載玻片,蓋上蓋玻片即可用不同倍數(shù)顯微鏡觀察。

1.2.2 免疫組化檢測 按文獻〔5〕方法制作原頭節(jié)組織切片。Caspase-1與caspase-3抗體濃度按1∶300稀釋。切片經(jīng)高壓熱修復(fù),其余均按試劑盒說明操作。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色,蘇木素復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下觀察。caspase-1與caspase-3均以細胞漿(可包括細胞核)被染成棕黃色為陽性,無黃染者為陰性。另以PBS代替Ⅰ抗以排除假陽性。

1.2.3 T UNEL檢測 按試劑盒說明操作。原頭節(jié)用4%中性甲醛固定24～48 h后,先后用瓊脂糖和石蠟包埋原頭節(jié),制作厚4 μ m的組織切片。經(jīng)DAB顯色和蘇木素復(fù)染后,顯微鏡觀察。凋亡細胞的細胞核被T UNEL試劑染成棕黃色,正常細胞核不著色,正常細胞核可被蘇木素復(fù)染成藍色。

1.2.4 透射電鏡觀察 收集的原頭節(jié)用無菌生理鹽水洗滌1次,用4%戊二醛前固定24 h,再用1%鋨酸后固定、丙酮梯度脫水、Epon812環(huán)氧樹脂包埋后,用瑞典LKB-2188超薄切片機切成60nm厚,鉛鈾電子染色,日本JEOL1230透射電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 普通顯微鏡觀察 直接采集原頭節(jié)用顯微鏡觀察,可見一些原頭節(jié)結(jié)構(gòu)清晰、完整,透光性良好,鈣顆粒清亮而明顯(圖1-箭頭所指);一些原頭節(jié)體積縮小,透光性降低,鈣顆粒變小或模糊不清,呈現(xiàn)枯萎征象(圖1-紅邊框箭頭所指)。

圖1 顯微鏡觀原頭節(jié)形態(tài)(×400)Fig.1 Morphology of protoscolex under microscope(×400)

2.2 免疫組化檢測 在收集的原頭節(jié)中,在同一張切片,甚至同一個育囊中,一些原頭節(jié)很少或幾乎無caspase-1、caspase-3表達(圖2、圖 3之 箭頭所指),一些原頭節(jié)則呈現(xiàn)極強的caspase-1、caspase-3表達(圖2、圖3之紅邊框箭頭所指)。而PBS代替Ⅰ抗者,所有原頭節(jié)都呈陰性反應(yīng),由此也排除了假陽性。

2.3 TUNEL檢測 用TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn),在上述caspase-1、caspase-3強表達的原頭節(jié)中同樣檢測到了大量調(diào)亡細胞(圖4之紅邊框箭頭所指)。檢測結(jié)果與caspase蛋白表達高度一致。

圖4 TUNEL檢測結(jié)果Fig.4 Result detected by TUNEL assay

2.4 透射電鏡觀察 在收集的原頭節(jié)中,正常原頭節(jié)體被合胞體帶向外長有排列整齊的微毛,微毛外側(cè)有較厚的PAS陽性物質(zhì),原頭節(jié)內(nèi)部實質(zhì)細胞呈圓形或橢圓形,細胞核大而明顯,核仁居中,核內(nèi)染色質(zhì)比較細膩,異染色質(zhì)較少(圖5-A)。除正常原頭節(jié)之外,還見到了典型細胞凋亡形態(tài)改變的原頭節(jié),表現(xiàn)為原頭節(jié)皮層微毛外PAS陽性物質(zhì)消失,內(nèi)部實質(zhì)細胞胞質(zhì)濃縮,并可見凋亡小體形成等細胞凋亡特征性改變(圖5-B、C)。

圖5 原頭節(jié)的透射電鏡觀察Fig.5 Observation on protoscolexby transmission electron microscope

3 討 論

凋亡細胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(缺口),暴露出大量3′羥基末端,如用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(-dUTP)進行缺口末端標記,則可原位特異地顯示出凋亡細胞,此即原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)——TUNEL法〔6〕。T UNEL法是一種將分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,可對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確地反應(yīng)細胞凋亡時典型的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征,不僅可用于從培養(yǎng)細胞和組織中分離的凋亡細胞的形態(tài)鑒定,亦可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片等。TUNEL法可檢測出極少量的凋亡細胞,因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用〔7〕。本文用 T UNEL法對自然狀態(tài)原頭節(jié)進行檢測,發(fā)現(xiàn)有些原頭節(jié)存在不同程度的細胞凋亡。

迄今為止,透射電鏡仍然為最經(jīng)典、可靠的判定細胞凋亡的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。電鏡下可清晰地觀察到細胞凋亡的特征性的超微結(jié)構(gòu)改變:如凋亡細胞體積變小,細胞質(zhì)濃縮;核染色質(zhì)凝聚、邊緣化,呈新月形;胞質(zhì)緊實,細胞器集中,胞膜起泡;凋亡晚期的細胞核裂解為碎塊,形成凋亡小體或可見凋亡小體被鄰近巨噬細胞吞噬的現(xiàn)象,等〔7〕。本文在自然狀態(tài)原頭節(jié)中見到有的原頭節(jié)呈現(xiàn)細胞質(zhì)濃縮和凋亡小體形成等典型細胞凋亡改變,進一步證明棘球蚴原頭節(jié)自身存在細胞凋亡的現(xiàn)象。

Caspase-1、caspase-3是細胞凋亡在執(zhí)行階段起中心作用的兩個半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶。Caspase-1即白介素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ICE),與線蟲自殺基因蛋白(CED-3)是同源物,其一級結(jié)構(gòu)與CED-3有28%的同源性,可發(fā)揮與CED-3相似的作用。Caspase-3即相對分子質(zhì)量32 000的半胱氨酸蛋白酶(CPP32),是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。未活化的半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Pro-caspase-3)與 CED-3有 35%同源,是 caspase家族中與CED-3同源性最高的,不論結(jié)構(gòu)同源性還是底物特異性,都與 CED-3相似〔8〕。所以有人認為它是CED-3在哺乳動物中的同源蛋白。另外,有報道認為檢測 caspase-3可用來區(qū)分細胞死亡的兩種形式——凋亡與漲亡,認為caspase-3在細胞凋亡中發(fā)揮核心作用,而在漲亡細胞中呈陰性表達〔9〕。關(guān)于棘球絳蟲細胞凋亡的具體機制目前尚不清楚。本文利用免疫組化技術(shù),選用能與多種哺乳動物起交叉反應(yīng)的caspase-1、caspase-3的多克隆抗體進行檢測,并用PBS代替Ⅰ抗作陰性對照,以排除假陽性反應(yīng)。結(jié)果在以上T UNEL法檢測陽性的自然狀態(tài)原頭節(jié)中檢測到caspase-1和caspase-3明顯表達。這不僅進一步證實細胞凋亡的存在,也提示原頭節(jié)中存在與ced-3類似的細胞凋亡基因。

作者已經(jīng)在體外成功地用過氧化氫〔10〕和地塞米松聯(lián)合 AT P〔11〕誘導(dǎo)棘球蚴原頭節(jié)發(fā)生細胞凋亡,并在被誘導(dǎo)的原頭節(jié)中檢測到caspase-3活性明顯增高。本文又觀察到棘球蚴原頭節(jié)在宿主體內(nèi)自身產(chǎn)生的細胞凋亡現(xiàn)象。進一步搞清原頭節(jié)產(chǎn)生細胞凋亡的機制,將為治療包蟲病新方法的探索提供理論依據(jù)。

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