耿彥生,張 碩,趙晨燕,汪葆玥,田克恭,王佑春

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要經(jīng)腸道傳播,既可散發(fā)也可暴發(fā)流行,我國(guó)是戊型肝炎的流行區(qū)。目前研究認(rèn)為戊型肝炎為人畜共患疾病,豬是HEV的重要儲(chǔ)存宿主和傳染源〔1〕。除了豬之外,其他許多動(dòng)物體內(nèi)也檢測(cè)到了HEV抗體,表明這些動(dòng)物也存在HEV的感染〔2〕。最近美國(guó)學(xué)者從患肝脾腫大的雞體內(nèi)分離到一種新病毒,命名為禽戊型肝炎病毒(禽HEV),隨后的研究發(fā)現(xiàn)健康雞的體內(nèi)也存在禽HEV感染〔3〕。為了解我國(guó)家禽戊型肝炎病毒的感染情況,我們分別在我國(guó)南方和北方15省、市(或自治區(qū))采集了雞和鴨的血清,進(jìn)行了HEV抗原、抗體以及HEV RNA的檢測(cè),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 血清樣本雞、鴨血清樣本由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心于2008年10-11月份采集于我國(guó)的15個(gè)省、市、自治區(qū),每個(gè)省份選取1-2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)。血清采集后低溫保存和運(yùn)輸,到實(shí)驗(yàn)室后-20℃凍存。

1.2 血清HEV抗體和抗原的檢測(cè) 應(yīng)用北京萬(wàn)泰藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的戊型肝炎病毒抗原診斷試劑盒和戊型肝炎病毒總抗體(HEV-Ab)診斷試劑盒進(jìn)行HEV抗原、抗體的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 HEV RNA的檢測(cè) 根據(jù)血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果,對(duì)抗體陽(yáng)性率較高的陜西、西藏和海南3個(gè)省份的所有血清樣本以及其它HEV抗原陽(yáng)性樣本進(jìn)行HEV核酸檢測(cè)。應(yīng)用北京金豪制藥股份有限公司生產(chǎn)的戊型肝炎病毒 RNA檢測(cè)試劑盒,對(duì)血清樣本進(jìn)行RNA提取。應(yīng)用能夠擴(kuò)增HEV 1-4型的ORF2區(qū)域引物〔4〕和能夠擴(kuò)增ORF1解旋酶區(qū)域的保守的通用禽 HEV引物〔3〕,通過套式RT-PCR進(jìn)行HEV RNA和禽HEV RNA檢測(cè)。

前者外引物為:

內(nèi)引物為:

后者的外引物為:

內(nèi)引物為:

RT-PCR的反應(yīng)條件與文獻(xiàn)描述相同〔3-4〕。

2 結(jié) 果

2.1 雞血清HEV抗原、抗體檢測(cè)結(jié)果 本研究共檢測(cè)來自15個(gè)省、市、自治區(qū)的雞血清1 507份,其中54份標(biāo)本為HEV抗體陽(yáng)性,平均陽(yáng)性率為3.58%(表1)。山西、山東和四川的標(biāo)本中未檢出HEV抗體,其他12個(gè)省份HEV抗體陽(yáng)性檢出率在1.02%至9.09%之間,不同省份之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;將北方省份,即天津、山西、內(nèi)蒙古、山東、陜西、寧夏、新疆、西藏8省、市的平均陽(yáng)性率3.28%(34/1 038)與南方省份四川、江蘇、上海、廣東、福建、江西、海南的平均陽(yáng)性率4.26%(20/469)進(jìn)行比較,并沒有顯著性差異(χ2=0.91,0.25＜P＜0.05)。HEV抗體陽(yáng)性標(biāo)本S/CO值最高為18.96,54個(gè)陽(yáng)性樣本的平均值為 4.51±5.84。15個(gè)省、市的1 507份雞血清中,8個(gè)省市的26份血清HEV抗原陽(yáng)性,總陽(yáng)性率為1.73%(26/1 507),26份抗原陽(yáng)性血清的平均S/CO值為2.44±1.82。8個(gè)省市的抗原陽(yáng)性率在0.24%至11.11%之間,不同省份的陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;將南方7省市的平均抗原陽(yáng)性率3.41%(16/469)與北方8省市的抗原平均陽(yáng)性率0.96%(10/1038)進(jìn)行比較,南方的陽(yáng)性率高于北方(χ2=11.4,P＜0.05)。

2.2 鴨血清抗原、抗體檢測(cè)結(jié)果 140份鴨血清取自我國(guó)南方五個(gè)省份(或市),其中10份血清為HEV抗體陽(yáng)性,陽(yáng)性率為7.14%(10/140),陽(yáng)性樣品的平均S/CO值為3.07±2.14(表2)。福建和上海的血清中分別有1份為HEV抗原陽(yáng)性,平均陽(yáng)性率為1.43%(2/140)。

將鴨血清的HEV抗體陽(yáng)性率7.14%(10/140)與同樣5省份雞血清的平均抗體陽(yáng)性率5.64%(19/337)進(jìn)行比較,沒有顯著性差異(χ2=1.68,0.1＜P＜0.25);兩者的平均S/CO值相比較也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用Nested PCR,分別以1-4型HEV基因組為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的ORF2區(qū)域的引物,以及禽HEV基因組為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的ORF1區(qū)域的引物對(duì)HEV抗體陽(yáng)性率較高的陜西和海南的全部雞血清樣本以及其他HEV抗原陽(yáng)性的雞血清和鴨血清樣本進(jìn)行HEV RNA檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3 討 論

根據(jù)基因組變異性,人和其它哺乳動(dòng)物HEV主要分為四個(gè)基因型,即基因1型、2型、3型和4型。由于HEV ORF2區(qū)域氨基酸序列保守,不同基因型存在血清學(xué)交叉反應(yīng),目前認(rèn)為HEV血清型只有一個(gè)〔1〕。禽HEV被歸為戊型肝炎病毒屬,暫定為基因5型〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)基因重組禽HEV的ORF2蛋白既含有其獨(dú)有的抗原表位,同時(shí)也含有與人、豬 HEV共有的抗原表位〔5-6〕。禽 HEV和人HEV(基因1型)ORF2區(qū)域在氨基酸水平具有約56%～62%同源性,ORF2蛋白抗原及相應(yīng)單克隆或多克隆抗體存在交叉反應(yīng)〔2-3〕。因此,應(yīng)用哺乳動(dòng)物HEV ORF2蛋白作為已知抗原制備的EIA試劑盒,既可檢測(cè)1-4型HEV相應(yīng)抗體也可以檢測(cè)禽HEV抗體,但檢測(cè)后者的靈敏度可能比較低。本研究中所用EIA試劑盒采用雙抗原夾心法檢測(cè)抗體,即通過預(yù)先包被的基因1型HEV ORF2重組蛋白抗原吸附待檢血清中的HEV抗體,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的ORF2蛋白抗原再與已吸附的抗體結(jié)合,所以也能夠檢測(cè)禽HEV的相應(yīng)抗體,并且檢測(cè)的HEV抗體為血清中的總抗體,即包括HEV IgM 抗體和IgG抗體,提高了檢測(cè)靈敏度〔7〕。

我國(guó)在多種家畜中檢測(cè)到了HEV抗體,并且已經(jīng)證實(shí)自豬體內(nèi)分離到的HEV與HEV散發(fā)病例中分離到的人 HEV有高度同源性,有些散發(fā)HEV病例的發(fā)生可能與豬HEV的傳播有關(guān)〔4,7-8〕。然而,雖然也有關(guān)于家禽HEV的血清流行病學(xué)的研究報(bào)告,但可能由于研究方法不一致,或者樣本量比較小,禽類是否有HEV感染并沒有得出明確的結(jié)論。本次研究中,雞和鴨血清都有 HEV抗體陽(yáng)性樣本檢出,雞、鴨總陽(yáng)性率分別為3.58%和7.14%。并且我們發(fā)現(xiàn)有些血清樣本HEV抗體滴度很高,雞血清S/CO值最高可達(dá)18.96,與豬血清的最高值接近〔7〕。血清中HEV抗原的出現(xiàn)是表明HEV感染的一個(gè)更直接指標(biāo),本研究應(yīng)用HEV EIA抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)雞和鴨血清中都有抗原陽(yáng)性樣本,陽(yáng)性率分別為 1.73%和1.43%。這些結(jié)果說明我國(guó)家禽中確實(shí)存在HEV或者禽HEV的流行。

表1 雞血清HEV抗原、抗體檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection of anti-HEV antibody and HEV antigen in chicken sera

表2 鴨血清HEV抗原、抗體檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection of anti-HEV antibody and HEV antigen in duck sera

在15個(gè)省份的雞和5個(gè)省份的鴨血清樣本中,分別有12個(gè)省份的雞和 4個(gè)省份的鴨檢測(cè)到了HEV抗體,不同省份之間雞和鴨HEV抗體陽(yáng)性率都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于每個(gè)省份只選取了某一地區(qū)的1-2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集標(biāo)本,各省份的HEV抗體陽(yáng)性率不一定能夠表明該省份的真實(shí)流行情況,但可以說明不同養(yǎng)殖場(chǎng)或不同雞群或鴨群HEV抗體陽(yáng)性率存在差異。這與豬HEV感染情況的結(jié)果一致,養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境、衛(wèi)生條件等影響豬HEV抗體陽(yáng)性率〔9〕。為了解氣候及地理因素是否影響禽類HEV的流行,我們將北方8省份雞抗體平均陽(yáng)性率與南方7省份的雞抗體平均陽(yáng)性率進(jìn)行比較,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯差異;但南方省份雞血清的抗原陽(yáng)性率高于北方省份,除西藏外,多數(shù)北方省份的雞血清樣本沒有檢出HEV抗原或抗原檢出率很低。HEV感染通常為急性,HEV抗原陽(yáng)性表明家禽正處于急性感染期。本次研究的血清標(biāo)本采自10-11月份,此時(shí)北方逐漸變得寒冷、干燥,而南方依然炎熱、潮濕。此結(jié)果表明,HEV在家禽中的傳播可能會(huì)受地理、氣候的影響,但仍需進(jìn)一步研究確證。來自南方五省份的鴨血清的HEV抗體陽(yáng)性率與同樣五省份的雞血清陽(yáng)性率進(jìn)行比較,沒有明顯差異。

哺乳動(dòng)物HEV是否能夠跨種屬感染禽類,目前還不清楚。但最近我國(guó)學(xué)者報(bào)告,在一個(gè)相對(duì)封閉的野生動(dòng)物園的鳥類糞便中分離到了兩株4型HEV〔10〕。本次研究所應(yīng)用的檢測(cè)HEV的PCR引物為HEV ORF2簡(jiǎn)并引物,高度保守,除人和豬HEV外,最近應(yīng)用此引物在兔血清中檢測(cè)到了HEV RNA〔11〕,但在 HEV 抗原陽(yáng)性26份雞血清和2份鴨血清中,以及抗體陽(yáng)性率較高省份的其它雞、鴨血清中,沒有檢測(cè)到哺乳動(dòng)物 HEV RNA。禽HEV感染在美國(guó)等國(guó)家雞群中普遍存在〔2〕,但到目前為止我國(guó)還沒有分離到禽HEV。本次試驗(yàn),我們應(yīng)用美國(guó)等國(guó)家所采用的禽HEV核苷酸序列高度保守的ORF1解旋酶區(qū)域引物對(duì)抗原陽(yáng)性標(biāo)本和抗體陽(yáng)性率較高的省份血清標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR,也沒有得到陽(yáng)性結(jié)果。其主要原因可能是由于HEV基因組存在地理性差異〔1〕,流行于美國(guó)的禽HEV和流行于我國(guó)的禽HEV核苷酸序列差異比較大,以其為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的引物與我國(guó)禽HEV吻合性差,致使RT-PCR的檢測(cè)靈敏度降低。那么在我國(guó)雞群中流行的HEV究竟是哺乳動(dòng)物HEV(1-4型)跨種感染,或者是禽HEV在雞群中流行,目前仍不清楚,還需要進(jìn)一步研究。

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