李 忠,丁淑軍,呂 慧,陳 勇,侯配強(qiáng),王顯軍

人粒細(xì)胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)是由嗜吞噬細(xì)胞無形體侵染人末梢血中性粒細(xì)胞引起,以發(fā)熱伴白細(xì)胞、血小板減少和多臟器功能損害為主要臨床表現(xiàn)的蜱傳人畜共患傳染性疾病〔1-2〕。該病呈世界分布,但報(bào)道主要來自歐美地區(qū)〔3-4〕。近年分子生物學(xué)證據(jù)及血清學(xué)證據(jù)都證實(shí)亞洲許多國家包括日本、韓國以及我國存在有該病〔5-6〕。2006年我國安徽省首次發(fā)生院內(nèi)無形體傳播感染事件〔7〕。在一項(xiàng)針對我國天津地區(qū)高危人群的調(diào)查結(jié)果顯示,我國農(nóng)牧區(qū)從事農(nóng)作物生產(chǎn)及畜牧業(yè)養(yǎng)殖人群無形體血清流行率達(dá)8.8%〔8〕。2008年5月下旬,我中心對泰安市疾控中心報(bào)告的1例不明原因發(fā)熱、伴白細(xì)胞和血小板減少病例進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,并采集其血液標(biāo)本開展了實(shí)驗(yàn)室檢測,結(jié)果如下。

1 病例發(fā)現(xiàn)經(jīng)過與治療

患者 xxx,女,41歲,漢族,泰安市新泰人。2008年5月11日不明原因開始出現(xiàn)發(fā)熱,最高達(dá)40℃,全身乏力。在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院使用替硝唑、左氧氟沙星、阿奇霉素等藥物治療,用藥后第4d出現(xiàn)嘔吐,遂到泰安市某醫(yī)院就診,給予對癥處理。5月18日7:00pm,突然出現(xiàn)昏迷,入住當(dāng)?shù)啬翅t(yī)院。5月19日中午轉(zhuǎn)到泰安市中心醫(yī)院以“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”收住院。入院診斷:“系統(tǒng)性紅斑狼瘡?、狼瘡性腦病?、血液系統(tǒng)損害、腎損害”。入院時(shí)神志淡漠,煩躁,呈現(xiàn)昏迷狀態(tài)。入院后血常規(guī)檢查:白細(xì)胞(1.95×109/L)和血小板(84×109/L)減少;尿蛋白陽性;轉(zhuǎn)氨酶升高;心肌酶譜升高。骨髓涂片示增生活躍,粒系增生,部分粒細(xì)胞漿中可見多少不一的粗大紫紅色顆粒及空泡。血涂片示白細(xì)胞數(shù)減少,粒細(xì)胞比例減低,可見異型淋巴細(xì)胞。血小板散在可見。臨床上排除了常見發(fā)熱疾病后,考慮到患者發(fā)熱,白細(xì)胞、血小板同時(shí)降低,且肝功轉(zhuǎn)氨酶升高,根據(jù)衛(wèi)生部2008年初下發(fā)的《人粒細(xì)胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》,中心醫(yī)院診斷為人粒細(xì)胞無形體病疑似病例,為求進(jìn)一步明確診斷,邀請省衛(wèi)生廳組織臨床和疾控專家會(huì)診。入院后經(jīng)醫(yī)院補(bǔ)液、應(yīng)用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、左氧氟沙星、復(fù)方甘露醇等治療不見好轉(zhuǎn),仍高燒不退、病情加重;會(huì)診后,使用強(qiáng)力霉素等抗立克次體感染藥物以及補(bǔ)液、輸血、物理降溫等對癥治療后,神志轉(zhuǎn)清,口齒逐漸清晰,40余天后痊愈出院。

2 流行病學(xué)調(diào)查

患者所在的村為一自然村,100多戶人家,340-350人,以農(nóng)作物種植、養(yǎng)蠶為主要收入來源,屬于丘陵地帶。平日在家務(wù)農(nóng),有20余畝地,種植有花生、核桃、地瓜、楊樹等農(nóng)作物。院子門口有野草,屋后為莊稼地。家中飼養(yǎng)2只狗,1只羊,在其中1只狗和羊身上發(fā)現(xiàn)有蜱,狗在屋后莊稼地里飼養(yǎng),狗身上發(fā)現(xiàn)眾多蜱寄生,捕獲后初步鑒定為硬蜱。患者家居住在村西南邊,家中衛(wèi)生條件一般。發(fā)病前無外出史。臨床考慮為人粒細(xì)胞無形體感染后,追問有無蜱叮咬史,但患者自述發(fā)病前無蜱叮咬史。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測

無菌采集患者發(fā)病早期非抗凝血液標(biāo)本以及EDTA抗凝血標(biāo)本各3～5ml,血清分離后與抗凝血一同置-20℃保存作PCR檢測和核酸序列測定分析。PCR試劑盒(Taq聚合酶、dNTP、Buffer和DNA ladder)均購自大連寶生物工程有限公司,有效期內(nèi)使用。PCR儀為Biorad公司產(chǎn)品。PCR陽性對照由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病防制所立克次體室張麗娟老師惠贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)引物針對無形體16S rRNA基因設(shè)計(jì)。外引物Eh-out1(AF414399)序列:5'-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3';Eh-out2(AF414399)序列:5'-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3';內(nèi)引物HGA1和HGA2是無形體特異性引物,HGA1序列:5'-GTC GAA CGG ATT AT T CT T TAT AGC T TG-3';HGA2序列:5'-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3'。外引物擴(kuò)增片斷長度為653bp,內(nèi)引物擴(kuò)增片段長度為389 bp。DNA提取采用Qiagen公司生產(chǎn)的 DNA Blood Mini Kit對病例的抗凝血標(biāo)本提取模板DNA,具體步驟參見操作說明書,最后采用AE緩沖液50μL抽濾以提高回收的 DNA濃度。套式PCR第一輪PCR反應(yīng):反應(yīng)體系為25ul,其中buffer 2.5μL,dNT P 2μL,Eh-out1 和 Eh-out2 各 1μL,TaqE 0.125μL,DNA 模板 3μL,余用蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)條件第一輪94℃預(yù)變性5min,94℃變性45sec,55℃退火 50sec,72℃延伸1min,共40個(gè)循環(huán),最后72℃總延伸5min。第二輪PCR反應(yīng)取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物1μL,HGA1和 HGA2引物各 1μL,其余反應(yīng)參數(shù)不變。采用1%瓊脂糖凝膠電泳第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,凝膠成像系統(tǒng)拍照。

取第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50μL送Invitrogen公司作核酸序列測定分析。通過Internet網(wǎng)進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站點(diǎn)后,利用“BLAST”工具,與GenBank中注冊的HGA基因序列進(jìn)行同源性比較。

4 結(jié) 果

4.1 臨床化驗(yàn)檢查 血常規(guī):白細(xì)胞波動(dòng)在1.95×109/L～2.73×109/L之間,治療后,白細(xì)胞上升到6.15×109/L;血小板波動(dòng)在34×109/L～84×109/L之間;血紅蛋白波動(dòng)在64g/L～112g/L。谷丙轉(zhuǎn)氨酶最高達(dá) 284U/L,谷草轉(zhuǎn)氨酶最高達(dá)969U/L,總蛋白最低為 57.9g/L、白蛋白最低為27.4g/L。肌酸激酶最高為1276U/L,肌酸激酶同工酶58U/L,乳酸脫氫酶989IU/L,α-羥丁酸脫氫酶807IU/L,均升高。腎功檢測包括尿素(5.16mmol/L)及肌酐(105umol/L)均正常,尿蛋白 1.0/L。腰椎穿刺檢查:腦脊液壓力高,糖、蛋白、氯化物均高,未查見隱球菌及抗酸桿菌。血淀粉酶升高(605U/L)。

4.2 PCR電泳 以病人血液標(biāo)本提取的DNA為模板,行套式PCR。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約400bp大小,與陽性對照一致,見圖1。

4.3 序列分析結(jié)果 將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定,見圖2,并將所獲得序列提交到GenBank,序列號(hào)為Gu908492。測定結(jié)果輸入BLAST分析工具,進(jìn)行同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段與我國已報(bào)道的從浙江、吉林鼠中擴(kuò)增的相對應(yīng)序列(基因注冊號(hào)為DQ458808、DQ449948)相差1個(gè)堿基,同源性為99.7%,變異發(fā)生在117位堿基。根據(jù)衛(wèi)生部《人粒細(xì)胞無形體病診療方案(試行)》,全血或血細(xì)胞標(biāo)本PCR檢測嗜吞噬細(xì)胞無形體特異性核酸陽性,且序列分析證實(shí)與嗜吞噬細(xì)胞無形體的同源性達(dá)99%以上,是確診無形體病的主要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)之一。

圖1 PCR電泳結(jié)果1:DL2000 Marker;2:陰性對照;3:血標(biāo)本;4:陽性對照;5:DL2000 M arkerFig.1 Electrophoresis of PCR products1:DL2000 marker;2:negative control;3:Blood sample;4:Positive control;5:DL2000 Marker

圖2 PCR產(chǎn)物測序圖譜Fig.2 Sequencingmap of PCR product

5 討 論

患者為中年女性,居住丘陵地帶,家中飼養(yǎng)的狗、羊身上以及周圍環(huán)境中發(fā)現(xiàn)有蜱生存,衛(wèi)生條件較差,存在被蜱叮咬的可能性,有流行病學(xué)接觸史?；颊甙l(fā)病急,以發(fā)熱、乏力等非特異癥狀為臨床首發(fā)表現(xiàn),常規(guī)用藥效果不佳,且病情進(jìn)展比較快,很快出現(xiàn)昏迷等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。臨床化驗(yàn)室檢查,血常規(guī)檢測發(fā)病早期白細(xì)胞、血小板數(shù)均低于正常范圍,為無形體病早期診斷指標(biāo);肝功指標(biāo)顯示谷丙轉(zhuǎn)氨酶最高達(dá)284U/L,谷草轉(zhuǎn)氨酶最高達(dá)969U/L,均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常值4倍以上,同時(shí)總蛋白、白蛋白均降低,指示肝功能受損;心功能指標(biāo)肌酸激酶最高為1276U/L,肌酸激酶同工酶58U/L,均高于正常范圍,提示心功能亦受累及。腎功檢測指標(biāo)尿素及肌酐雖正常,但尿蛋白陽性,為1.0/L,提示腎功能亦有改變。腰椎穿刺時(shí),腦脊液壓力高,糖、蛋白、氯化物均高,支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,但未查見隱球菌及抗酸桿菌,排除了常見的隱球菌性腦膜炎和結(jié)核性腦膜炎。血淀粉酶605U/L,較正常值升高,提示胰腺功能改變。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢測顯示該病例合并有肝、腎、心、神經(jīng)系統(tǒng)多器官、多系統(tǒng)功能損害。采其抗凝血進(jìn)行套式PCR檢測,無形體核酸檢測陽性,且經(jīng)測序證實(shí)與無形體同源性在99%以上,從病原學(xué)上亦得到了支持的證據(jù)。該病例有流行病學(xué)接觸史,臨床上有發(fā)熱、乏力等表現(xiàn),實(shí)驗(yàn)室檢測有白細(xì)胞、血小板降低,肝功轉(zhuǎn)氨酶明顯升高,病原學(xué)HGA核酸檢測陽性,且經(jīng)測序證實(shí)。根據(jù)衛(wèi)生部《人粒細(xì)胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》的診斷標(biāo)準(zhǔn),該病例為人粒細(xì)胞無形體確診病例。

自1994年美國報(bào)告首例人粒細(xì)胞無形體病病例以來〔1〕,美國每年報(bào)告的病例約600～800人。目前美國多個(gè)州和歐洲多個(gè)國家都報(bào)導(dǎo)有人粒細(xì)胞埃立克體感染存在的證據(jù)。1999年以來高東旗等〔9〕報(bào)道從新疆的全溝硬蜱擴(kuò)增出人粒細(xì)胞埃立克體(2003年后國際統(tǒng)一命名為人粒細(xì)胞無形體)特異性DNA片段;2001年,高東旗等〔10〕又從內(nèi)蒙古大興安嶺采集的發(fā)熱病人血中擴(kuò)增出人粒細(xì)胞埃立克體16S rRNA,說明我國存在著HGA感染病例。該病為一新發(fā)傳染病,目前對該疾病的病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制、傳播途徑、臨床表現(xiàn)及治療方面的認(rèn)識(shí)尚不足,臨床上容易誤診為其他發(fā)熱性疾病。如果不能及時(shí)明確診斷,由于該病病情進(jìn)展比較快,往往造成病人多器官受累,增加死亡率。因此,加強(qiáng)該病的臨床診治水平及疾病檢測能力具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

感謝中美新發(fā)傳染病合作項(xiàng)目(No.1U2GGH000018-01)的技術(shù)支持,感謝泰安市疾控中心、新泰市疾控中心參與調(diào)查并對該調(diào)查給予大力支持!

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