徐 磊,吳移謀,劉良專,周 洲,陳超群,唐國芳,趙飛駿

肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)為1989年正式命名的一種嚴(yán)格真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物,常引起急慢性呼吸道疾病,同時(shí)還與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、冠心病及腦血管疾病等密切相關(guān)[1]。目前用于Cpn感染診斷的方法主要有血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷和細(xì)胞培養(yǎng)法等。血清學(xué)診斷因其簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)而成為Cpn感染的常規(guī)檢測方法[2],但該方法多為回顧性,且常因在重復(fù)感染者中IgM的缺乏而影響診斷價(jià)值;分子生物學(xué)方法能快速診斷Cpn感染,但也存在假陽性或假陰性的問題;傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)法也有耗時(shí)長,技術(shù)復(fù)雜等缺陷,但該法為病原學(xué)檢測保留了有機(jī)體的生物特征,出現(xiàn)假陽性的機(jī)率很小,因此細(xì)胞培養(yǎng)法可作為Cpn感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。本研究采用優(yōu)化后的細(xì)胞培養(yǎng)法從臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)Cpn,并對(duì)分離出的菌株進(jìn)行了初步毒力試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 2009年1月-5月在南華大學(xué)附屬醫(yī)院就診的260例患者的咽拭子和32例肺泡灌洗液,其中男186例,女106例,年齡4～78歲;所有患者均有急性呼吸道感染癥狀,采樣前2w內(nèi)未服用過大環(huán)內(nèi)酯類藥物。

1.1.2 Hep-2細(xì)胞(人喉癌細(xì)胞) 由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)室保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清購自Gibco公司;TagDNA聚合酶購自Promega公司;細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒購自北京天根公司;抗生素均購自Sigma公司;Cpn鼠單克隆抗體購自Abcam公司;FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體購自北京博奧森公司。生物安全柜購自Haier公司;高速冷凍離心機(jī)AvantiTMJ-25購自 Beckman公司;CO2培養(yǎng)箱購自Sanyo公司。

1.1.4 培養(yǎng)基的配制生長培養(yǎng)基 加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;維持培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和放線菌酮、兩性霉素B、鏈霉素、萬古霉素(終濃度分別 0.8μ g/mL、10μ g/mL、10μ g/mL、100μ g/mL);轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基(SPG):將蔗糖75.0g,KH2PO40.52g,Na2HPO41.22g,L–谷氨酸0.72g溶于800mL去離子水中,調(diào)pH值至7.4,用去離子水定容至1L,0.2μ m濾器抽濾除菌,分裝后4℃或-20℃保存。

1.2 標(biāo)本的采集與處理 標(biāo)本的采集與處理按以下方法進(jìn)行:①每100mLSPG培養(yǎng)基加入無菌胎牛血清10mL和兩性霉素B、鏈霉素、萬古霉素(終濃度分別為 10μ g/mL、10μ g/mL、100μ g/mL);②用聚酯纖維棉簽采集患者咽拭子標(biāo)本,拭子置于盛有SPG培養(yǎng)基的Eppendorf管中(2mL);肺泡灌洗液與SPG培養(yǎng)基按1:2比例收集于Eppendorf管中(10mL);③轉(zhuǎn)運(yùn):標(biāo)本于4℃快速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室;④標(biāo)本如不能及時(shí)接種應(yīng)凍存于-70℃。

1.3 分離培養(yǎng)

1.3.1 PCR擴(kuò)增初篩 每份標(biāo)本取0.5mL提取全基因組DNA作為模板(具體操作按天根公司說明書)。16SrDNA擴(kuò)增引物參照Campbell[4]等公布的一對(duì)引物序列,即H L-1:5'-GT TGT TCATGAAGGCCTACT-3'和H R-1:5'-TGCATAACCTACGGTGTGTT-3'。反應(yīng)體系:總體積 25μL,其中 ddH2O 13μL、5 ×buffer 5μL、50μ m dNTP 2μL、10mM 引物各 1μL、Taq 酶 1μL ﹑ DNA 模板2μL。循 環(huán)參數(shù):94℃ 5min;94℃ 1min,55℃1min,72℃1min,循環(huán) 40次;72℃7min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 單層細(xì)胞的制備 取處于對(duì)數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至3×105/mL;將懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶或24孔板(內(nèi)置13mm滅菌圓蓋玻片,每孔加 1mL)中,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h。

1.3.3 Cpn的培養(yǎng):取 PCR初篩陽性的標(biāo)本50HZ超聲裂解10s,800r/min離心5min;單層細(xì)胞上加入少量含有 DEAE(終濃度 30μ g/mL)的DMEM培養(yǎng)基,37℃溫箱孵育10min;取超聲裂解后的標(biāo)本上清加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶或24孔板后2 000r/min,25℃離心30min;棄上清后加入維持培養(yǎng)基,置35℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 Giemsa染色 按 1∶9比例取Giemsa母液和Sorensen緩沖液(pH6.98)混合配成工作液;50%丙酮固定細(xì)胞后用Giemsa染液染色15min;倒置顯微鏡下觀察結(jié)果,計(jì)數(shù)包涵體形成單位(inclusion forming units,IFU)。

1.4.2 間接免疫熒光(IF)染色:50%丙酮固定細(xì)胞后加入稀釋后的一抗(Cpn鼠單克隆抗體),37℃孵育1h;洗板后加入稀釋后的二抗(FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG),37℃避光孵育1h,洗板后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,計(jì)數(shù)IFU。

1.4.3 16SrDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析 取少量接種后72h的細(xì)胞,提取DNA模板后進(jìn)行PCR擴(kuò)增(方法同初篩),將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測序。將測定所獲得的16SrDNA序列輸入GenBank,用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較分析;經(jīng)ClustalX程序進(jìn)行多重序列比對(duì)后,用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 Cpn的連續(xù)傳代

1.5.1 包涵體數(shù)目﹥5個(gè)按以下方法進(jìn)行傳代①棄去生長培養(yǎng)基,加入150μL SPG培養(yǎng)基;②刮取單層細(xì)胞移至細(xì)胞瓶和24孔板后按上述方法培養(yǎng)72h;③取24孔板單層細(xì)胞計(jì)數(shù)IFU。

1.5.2 包涵體數(shù)目為1～5個(gè)按以下方法進(jìn)行傳代①棄去生長培養(yǎng)基,加入150μL SPG培養(yǎng)基;②刮取單層細(xì)胞移至細(xì)胞瓶后按前述方法培養(yǎng)72h;③盲傳若干代后將單層細(xì)胞接種到24孔板計(jì)數(shù)IFU。

1.5.3 未觀察到包涵體的細(xì)胞應(yīng)盲傳若干代后進(jìn)行包涵體計(jì)數(shù),如仍未觀察到包涵體則放棄傳代,如觀察到包涵體則按上述方法進(jìn)行傳代。

1.6 毒力實(shí)驗(yàn)

1.6.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 遠(yuǎn)系交配鼠齡6w左右的BALB/c雄性小鼠30只,體重18～25 g。接種菌株組按接種的方法不同分為鼻飼接種組(9只)和靜脈接種組(9只);根據(jù)不同的處死時(shí)間(天數(shù))各分為3個(gè)小組,分別為第3、7、15d組,每個(gè)小組3只小鼠。對(duì)照組按接種的方法不同分為鼻飼接種組(6只)和靜脈接種組(6只),根據(jù)不同的處死時(shí)間各分為3個(gè)小組,分別為第3、7和15d組,每個(gè)小組2只小鼠。

1.6.2 接種方法 用Cpn懸液以鼻飼和靜脈途徑接種實(shí)驗(yàn)組小鼠,鼻飼接種組先用乙醚吸入誘導(dǎo)小鼠過度通氣,每只小鼠于吸氣相時(shí)向鼻孔內(nèi)滴入50μL接種物。靜脈接種組將小鼠固定后通過尾靜脈注射接種物50μL。鼻飼接種組的每只小鼠給予約3×106IFU/mL的 Cpn懸液,靜脈接種組的每只小鼠給予約4×106IFU/mL的Cpn懸液。對(duì)照組每只小鼠均接種50μL PBS。

1.6.3 接種后每天觀察小鼠的活動(dòng)及進(jìn)食等情況。至預(yù)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間,小鼠在乙醚麻醉下用眼球摘除方法處死。取左側(cè)肺用10%中性甲醛固定,再用石蠟包埋,切片和蘇木素-伊紅(HE)染色;光鏡下觀察病理變化特征。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本初篩 PCR產(chǎn)物片段大小為474bp左右視為初篩陽性。從292例標(biāo)本中共篩出陽性標(biāo)本15例,均用于Cpn分離培養(yǎng)。

2.2 Giemsa染色鑒定 用Giemsa染色法對(duì)接種后標(biāo)本進(jìn)行鑒定,結(jié)果兩份標(biāo)本為陽性,分離出的菌株分別命名為NH001和NH002。光學(xué)顯微鏡(×1000)下可見圓形或卵圓形、與細(xì)胞核相距較遠(yuǎn)、著色較深的包涵體(圖1-2箭頭所示),經(jīng)3次傳代后計(jì)數(shù) IFU分別為3.8×104和4.8×104。

圖1 菌株 NH001感染Hep-2細(xì)胞72h后Giemsa染色照片(×1 000)Fig.1 Strain NH001 in Hep-2 cell,72h after infection,Strained with Giemsa,×1 000.

2.3 IF染色鑒定 用IF染色法對(duì)接種后標(biāo)本進(jìn)行鑒定,結(jié)果與 Giemsa染色鑒定結(jié)果一致,即NH001和NH002為陽性。熒光顯微鏡(×1000)下可見散布的果綠色熒光,其中呈圓形、位于細(xì)胞輪廓內(nèi)側(cè)的為包涵體(圖3-4箭頭所示)。經(jīng)3次傳代后計(jì)數(shù)IFU分別為2.2×104和2.6×104。

2.4 16SrDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析 分別以NH001和NH002菌株基因組DNA為模板,用引物H L-2和H R-1對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,得到大小約474bp的產(chǎn)物。測序結(jié)果通過NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫與已知序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示NH001和NH002菌株與多個(gè)Cpn種同源性分別達(dá)96%和93%以上。通過MEGA4.1軟件計(jì)算分析,構(gòu)建 NH001和NH002的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示菌株NH001和NH002均與Cpn形成一個(gè)簇群(圖5、6)。結(jié)合Giema和IF染色鑒定結(jié)果,將其鑒定為Cpn。

圖5 基于16SrDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NH001)Fig.5 Phylogenetic tree of strain NH001 based on 16S rDNA sequences homology.Evolutionary distances showed in the figure were calculated by MEGA4.1;Bootstrap=1000.Bar,0.001 substitution per nucleotide.

2.5 Cpn感染后小鼠的一般情況 接種后小鼠全部存活,對(duì)照組小鼠進(jìn)食﹑活動(dòng)均無異常表現(xiàn)。接種NH001和NH002菌株組均在接種后8h左右開始出現(xiàn)豎毛、寒戰(zhàn)等癥狀,活動(dòng)度降低,進(jìn)食減少;第1～6d上述癥狀進(jìn)一步加重;第7d開始逐漸緩解,至12d上述癥狀消失。鼻飼接種組癥狀均較靜脈接種組重,接種NH001和NH002菌株后小鼠的癥狀未見明顯差異。第15d稱取小鼠重量,接種菌株組比對(duì)照組輕約1/4～1/3。

圖6 基于16SrDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NH002)Fig.6 Phylogenetic tree of strain NH002 based on 16S rDNA sequences homology.Evolutionary distances showed in the figure were calculated by MEGA4.1;Bootstrap=1000.Bar,0.001 substitution per nucleotide.

2.6 病理改變 小鼠肺組織切片:HE染色后鏡下觀察結(jié)果:對(duì)照組小鼠肺部均未出現(xiàn)明顯病理改變(圖7.1)。接種NH001和NH002菌株組都出現(xiàn)肺泡間隔明顯增厚,淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤,為明顯“間質(zhì)性肺炎”改變;其中均以鼻飼接種7d組病理改變(圖7.2、7.3)最為嚴(yán)重,病變范圍達(dá)2～3個(gè)肺葉,管腔內(nèi)有少量滲出。其中1只鼻飼接種NH002菌株的小鼠還合并有支氣管壁充血、中性粒細(xì)胞浸潤,管腔內(nèi)充滿滲出物等病變,為“支氣管化膿性”改變(圖7.4)。

圖7 小鼠肺組織切片(HE染色,×200)7.1鼻飼接種PBS后7d;7.2鼻飼接種NH001菌株后7d;7.3、7.4鼻飼接種 NH002菌株后7d。Fig.7 Micrographs of the lung tissues in the mice(HE staining,×200)。7.1 M ouse lung sections 7 day after intranasal inoculation with PBS.7.2 Mouse lung sections 7 day after intranasal inoculation with NH001.7.3、7.4 Mouse lung sections 7 day after intranasal inoculation with NH002

3 討 論

迄今為止,人們對(duì)Cpn的生物學(xué)、遺傳學(xué)了解甚少[5],Cpn是公認(rèn)對(duì)生長條件較苛刻的微生物之一,難以從初始標(biāo)本中分離培養(yǎng)成功。我們參照國外經(jīng)驗(yàn),通過對(duì)培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化,目前已能較穩(wěn)定的進(jìn)行Cpn分離培養(yǎng)。

Cpn能否從臨床標(biāo)本中成功分離在很大程度上取決于標(biāo)本的質(zhì)量。目前臨床上常用的一些抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類能殺滅Cpn,因此2w內(nèi)使用過大環(huán)內(nèi)酯類藥物的患者標(biāo)本不宜用于Cpn培養(yǎng)。由于藻酸鈣拭子、棉拭子和木棒等能抑制Cpn的生長,因此采集鼻咽部或口腔標(biāo)本時(shí)最好使用滌綸拭子、鋁棒或塑料棒。在采集咽拭子標(biāo)本過程中應(yīng)盡量避免混合痰液,這是由于痰對(duì)單層細(xì)胞有毒性作用而影響Cpn的培養(yǎng)。衣原體的生物活性在蔗糖和谷氨酸中保持較好,故標(biāo)本應(yīng)用衣原體轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基收集并在4℃轉(zhuǎn)運(yùn)。最常用的轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基有蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸緩沖液(SPG)和2蔗糖-磷酸鹽緩沖液(2SP)。標(biāo)本獲得后應(yīng)立即用于接種。研究表明:Cpn放置1d,在室溫下?lián)p失99%的傳染性滴度;放置4℃損失30%;直接于-75℃凍存,滴度損失近61%;-75℃凍存前放置4℃0.5～4h,其傳染性滴度減少約23%[6]。

Cpn為專性細(xì)胞內(nèi)寄生,因此選擇敏感的細(xì)胞系非常重要。HeLa、BHK-21、McCoy、HL 和 Hep-2細(xì)胞均能用于Cpn接種,但目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HL和Hep-2細(xì)胞在敏感性和穩(wěn)定性方面是最適合培養(yǎng)Cpn的細(xì)胞系[7-8]。接種時(shí)單層細(xì)胞密度過大對(duì)于Cpn接觸細(xì)胞表面不利,同時(shí)會(huì)造成營養(yǎng)物質(zhì)的搶奪,從而影響Cpn的生長;細(xì)胞密度過小容易造成標(biāo)本的丟失。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn),Hep-2細(xì)胞在接種前細(xì)胞融合達(dá)70%～80%較為合適。

Cpn是通過吞噬作用進(jìn)入宿主體內(nèi)的,感染性原體吸附到宿主細(xì)胞表面是Cpn感染的第一步。研究發(fā)現(xiàn)DEAE預(yù)處理單層細(xì)胞能增加衣原體與宿主細(xì)胞之間的相互作用,同時(shí)也可增強(qiáng)衣原體在細(xì)胞膜上的穿透作用。本研究采用的DEAE工作濃度為30μ g/mL,在此濃度下 IFU顯著增加。對(duì)宿主細(xì)胞代謝的選擇性抑制是Cpn在宿主細(xì)胞生長的先決條件,其機(jī)理可能是使宿主細(xì)胞代謝減低,從而為Cpn提供更多的營養(yǎng)成分[3]。本研究采用的是具有動(dòng)物蛋白合成抑制功能的放線菌酮,工作濃度為0.8μ g/mL。離心也是分離培養(yǎng)Cpn的必要條件,其機(jī)制可能是由于離心力促進(jìn)Cpn與單層宿主細(xì)胞接觸,從而有利于Cpn進(jìn)入細(xì)胞膜,本研究選用2 000r/min,25℃離心30min。另有報(bào)道[9]以下方法能提高Cpn在Hep-2細(xì)胞中的生長效率:單層細(xì)胞用7%聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)預(yù)處理;延長培養(yǎng)時(shí)間至7d;分別在第3d﹑4d﹑5d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心。這些措施單獨(dú)使用時(shí)分別使IFU增長了2、5和69倍,而聯(lián)合使用可使IFU增長300倍以上。

本研究通過建立Cpn感染的小鼠模型,證實(shí)了BALB/c小鼠接種NH001和NH002菌株后可產(chǎn)生自限性間質(zhì)性肺炎,尤其以鼻飼接種組更為明顯,這與人類感染Cpn的途徑相似。1例NH002鼻飼接種組小鼠出現(xiàn)支氣管化膿性,我們考慮這是由于Cpn感染引起小鼠免疫力下降,從而合并其他致病菌所致,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中也遇到一些困難,比如在292份標(biāo)本中僅檢出PCR陽性標(biāo)本15例,陽性比例比以往報(bào)道的小,這可能是由于:①抗生素的廣泛使用使得臨床上Cpn近期感染人數(shù)下降;②在標(biāo)本采集與轉(zhuǎn)運(yùn)中一些不確定因素影響了標(biāo)本的質(zhì)量。在分離培養(yǎng)的過程中也出現(xiàn)了接種標(biāo)本后宿主細(xì)胞污染,從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的教訓(xùn)。本研究采用了加大抗生素用量和加入其它抗生素等方法,經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4倍濃度的鏈霉素和兩性霉素B作用6h效果較好,部分標(biāo)本可排除污染;其它一些抗生素如頭孢類亦可控制部分標(biāo)本的污染。

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