李作生 李保慶 王國(guó)臣

p21和p27基因是調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)基因。在細(xì)胞周期的G1/S期的調(diào)控中，通過(guò)與cyclin－cdk復(fù)合物結(jié)合抑制Rb蛋白磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，因而被認(rèn)為是抑癌基因。p21基因外顯子 3的 3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)第20堿基對(duì)存在單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，核苷酸出現(xiàn) C→T 突變(3’UTR 多態(tài)性)，p27基因第109密碼子存在V109G多態(tài)性，核苷酸出現(xiàn)T→G突變。研究表明p21和p27基因多態(tài)性與口腔鱗癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)［1－3］。本研究檢測(cè)了華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科和河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2003年1月至2006年1月女性人群中非小細(xì)胞肺癌(non－small cell lung carcinoma，NSCLC)遺傳易感性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與p21和p27基因單核苷酸多態(tài)性SNPs的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組選取110例NSCLC病例，經(jīng)手術(shù)或支氣管鏡檢查證實(shí)。年齡27～76歲，平均年齡57.1歲。對(duì)照組124例，年齡29～70歲，平均年齡54.9歲，無(wú)腫瘤及遺傳病史。

1.2 外周血白細(xì)胞DNA提取 研究對(duì)象均抽取外周靜脈血5 ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，于4℃冰箱保存，并于采血后1周內(nèi)提取外周血白細(xì)胞DNA。DNA提取采用蛋白酶K消化－飽和氯化鈉鹽析法。

1.3 p21、p27 SNPs基因分型 p21、p27基因型檢測(cè)應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP)方法進(jìn)行。p21 SNP 擴(kuò)增引物為 5’－GAATTTGCCGTTGGGTCAAG－3’(上游引物)和 5’－AGGAGAACACGGGATGAGGAG－3’(下游引物)［3］。p27 SNP 擴(kuò)增引物為5’－TGCAGACCCGGGAGAAAG－3’(上游引物)和 5’－CCGCTAACCCCGTCTGG－3’(下游引物)［3］。PCR反應(yīng)體系均為25 μl，其中模板 DNA 100 ng，10× PCR緩沖液 2.5 μl，Taq－DNA 聚合酶2.5 U，MgCl22.0mm ol/L，dNTPs 0.2mmol/L，上、下游引物各0.2 μmol/L。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 10 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s(p21)或 60℃ 45 s(p27)，72℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸 7 min。取 8 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶消化，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。p21基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ37℃酶切后，C/C基因型產(chǎn)物為133、256和479 bp 3個(gè)DNA片段，T/T基因型表現(xiàn)為133 bp和735 bp 2個(gè)片段，C/T雜合型表現(xiàn)為133、256、479、735 bp 4個(gè)片段(圖1)。p27基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BglⅠ37℃酶切后，T/T基因型表現(xiàn)為76 bp和378 bp 2 個(gè)片段，G/G 型為76、113、265 bp 3 個(gè)片段，T/G 型為76、113、265、378 bp 4個(gè)片段(圖2)。以蒸餾水替代模板DNA作為陰性對(duì)照。隨機(jī)抽取10%的DNA標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，比較基因型頻率的觀察值與預(yù)期值應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)。2組的基因型分布、等位基因型頻率的比較均采用四格表χ2檢驗(yàn)。以非條件Logistic回歸法計(jì)算表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(odds ratio，OR)及其 95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，并經(jīng)年齡校正，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般特征 2組的年齡構(gòu)成比、吸煙狀況間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 p21基因SNPs分布 所有DNA標(biāo)本均經(jīng)PCR－RFLP方法成功進(jìn)行了基因分型，所有重復(fù)分型結(jié)果均與原結(jié)果相符。

2.2.1 p21基因型分布在2組均符合 Hardy－Weinberg平衡。p21基因C和T等位基因在2組的分布間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，p21基因突變型(C/T+T/T)頻率在病例組(76.4%)顯著高于對(duì)照組(56.5%)(χ2=10.27，P ＜0.01)。攜帶T等位基因(C/T和T/T基因型)能顯著增加這一人群NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［經(jīng)年齡校正的 OR=2.60，95%CI(1.46，4.61)］。見(jiàn)表1、2。

2.2.2 根據(jù)個(gè)體吸煙狀況的分層分析表明，在不吸煙個(gè)體中，p21基因突變型頻率在病例組(86.0%)顯著高于對(duì)照組(56.4%)(χ2=19.02，P ＜0.01)。與C/C基因型相比，C/T和T/T基因型可顯著增高不吸煙女性的NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［經(jīng)年齡校正的 OR=4.95，95%CI(2.36，10.40)］。見(jiàn)表 2。

2.2.3 在對(duì)年齡進(jìn)行的分層分析顯示，在≥50歲年齡組，p21基因突變型頻率在病例組(76.6%)明顯高于健康對(duì)照組(56.7%)(χ2=8.48，P ＜0.01)。攜帶 C/T、T/T基因型較 C/C基因型能顯著增加50歲以上女性人群NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［經(jīng)年齡校正的 OR=2.68，95%CI(1.41，5.08)］。見(jiàn)表 2。

2.3 p27基因SNP分布 p27基因型分布在2組均符合Hardy－Weinberg平衡。p27等位基因頻率和基因型總體分布在病例組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。攜帶G等位基因不增加這一人群NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)吸煙狀況和年齡進(jìn)行的分層分析也未發(fā)現(xiàn)這一多態(tài)性與NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。見(jiàn)表 1、3。

2.4 p21、p27基因SNPs與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 對(duì)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的73例NSCLC患者進(jìn)行了分層分析。結(jié)果顯示，p21和p27基因多態(tài)性與NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。

圖1 PCR－PstⅠ酶切的p21SNP基因分型

圖2 PCR－BglⅠ酶切的p27SNP基因分型

3 討論

p21基因定位于人第6號(hào)染色體短臂的2帶1區(qū)(6p21.2)為單拷貝基因［4］。p21有幾種多態(tài)性，報(bào)道較多的是以下兩種多態(tài)性:一是在外顯子2第31密碼子(p21c31多態(tài)性)，核苷酸出現(xiàn)C→A改變，導(dǎo)致氨基酸出現(xiàn)絲氨酸－精氨酸(ser－arg)改變，并且有研究認(rèn)為A等位基因的出現(xiàn)使p21轉(zhuǎn)錄明顯下降從而使其蛋白表達(dá)減低［5］;另一種是3’UTR多態(tài)性。每一種多態(tài)性都被認(rèn)為能夠改變p21的功能［6］。p21多態(tài)性中的高風(fēng)險(xiǎn)基因型被認(rèn)為與包括口腔鱗癌、乳腺癌及前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤有關(guān)［1－3］。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，表明攜帶C/T、T/T基因型較之C/C型能顯著增加這一人群NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

表1 2組一般情況及等位基因型頻率 例(%)

表2 p21基因多態(tài)性分層分析 例(%)

表3 p27基因多態(tài)性分層分析 例(%)

表4 p21和p27基因型與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 例(%)

吸煙是公認(rèn)的肺癌發(fā)病危險(xiǎn)因素，且有研究認(rèn)為某些基因多態(tài)性在肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)方面與吸煙有協(xié)同作用［7］，但本研究顯示，p21突變型只增加不吸煙女性NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并未發(fā)現(xiàn)吸煙與攜帶T等位基因?qū)υ黾覰SCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有相互作用。因此，對(duì)p21 SNP僅影響不吸煙者肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的確切機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

本研究以年齡50歲為界進(jìn)行了分層分析，結(jié)果顯示在≥50歲年齡組中，p21基因突變型能顯著增加50以上人群NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這一結(jié)果也提示在NSCLC的發(fā)病中，在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，外界環(huán)境因素持續(xù)或間斷作用于機(jī)體，經(jīng)過(guò)數(shù)年引起的代謝改變，最終導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生。

p27基因定位于人第12號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶和1區(qū)3帶第一亞帶之間(12p12－12p13.1)［8］。目前報(bào)道的p27 SNP位于第109密碼子，核苷酸出現(xiàn)T→G突變(GTC→GGC)，導(dǎo)致氨基酸出現(xiàn)纈氨酸(Val)→甘氨酸(Gly)替代，即V109G多態(tài)性。在本研究中，沒(méi)有顯示出p27突變基因型與NSCLC易感性有關(guān)，經(jīng)吸煙狀況、年齡進(jìn)行的分層分析也均未顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Kibel等［3］的研究則認(rèn)為VV基因型(T/T基因型)是危險(xiǎn)基因型，該基因型增加了晚期前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Thomas等［1］的研究則認(rèn)為攜帶突變型(T/G、G/G)的早期乳腺癌患者預(yù)后差。Li等［2］也認(rèn)為在口腔鱗癌中，突變的G/G型是危險(xiǎn)因素。上述研究結(jié)果說(shuō)明對(duì)于p27V109G多態(tài)性的研究結(jié)果存在較大分歧。另外，p27基因在腫瘤細(xì)胞中很少有突變和甲基化，且其功能的改變是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，因此對(duì)于其基因多態(tài)性與腫瘤易感性的相關(guān)性研究的價(jià)值可能會(huì)降低［8，9］。

腫瘤是否發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是決定個(gè)體治療方案和預(yù)測(cè)患者預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)。雖然有研究顯示p21低表達(dá)使腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加［9］，攜帶p27V109G突變型能增加乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目［1］，但我們的研究結(jié)果顯示，p21和p27基因多態(tài)性不增加NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

1 Thomas S，Lewin E，Uwe－Jochen G，et al.The V109G polymorphism of the p27 gene CDKN1B indicates a worse outcome in node－negative breast cancer patients.Tumor Biology，2004，25:306－312.

2 Li G，Sturgis EM，Wang LE，et al.Association between the V109G polymorphism of the p27 gene and the risk and progression of oral squamous cell carcinoma.Clin Cancer Res，2004，10:3996－4002.

3 Kibel AS，Suarez BK，Belani J，et al.CDKN1A and CDKN1B Polymorphisms and Risk of Advanced Prostate Carcinoma.Cancer Res，2003，63:2033－2036.

4 Smith CAD，Smith G，Wolf CR.Genetic polymorphisms in xenobiotic metabolism.Eur J Cancer 1994，30:1921－1935.

5 Su L，Sai Y，F(xiàn)an R，et al.P53(codon 72)and P21(codon 31)polymor－phisms alter in vivo mRNA expression of p21.Lung Cancer，2003，40:259－266.

6 Mousses S，Ozcelik H，Lee PD，et al.Two variants of the CIP1/WAF1 gene occur together and are associated with human cancer.Hum Mol Genet，1995，4:1089－1092.

7 Yu CY，Pan KF，Xing DY，et al.Correlation between a single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase－2 promoter and risk of lung cancer.Cancer Res，2002，62:6430－6433.

8 Ponce－Castaneda V，Lee MH，Latres E，et al.p27kip1:chromosomal mapping to 12p12－12p13.1 and absence of mutations in human tumors.Cancer Res，1995，55:1211－1214.

9 管曉翔，陳龍邦.腫瘤細(xì)胞蛋白錯(cuò)位分布和低表達(dá)的分子機(jī)制.中華腫瘤防治雜志，2006，13:786－789.