趙凌杰 焦東東 張永文 商瑋 蔡輝

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是心室重塑的重要表現(xiàn)，是各種心血管疾病共有的進(jìn)程，嚴(yán)重影響患者心功能甚至生活質(zhì)量，腎素－血管緊張素系統(tǒng)(RAS)過度激活在其中發(fā)揮重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為誘導(dǎo)MF、心肌細(xì)胞肥大過程中的主要介質(zhì)，對細(xì)胞間質(zhì)膠原的沉積至關(guān)重要，其過度表達(dá)導(dǎo)致心肌代謝及功能異常，使其僵硬度增高，舒縮功能障礙。我們利用腹主動(dòng)脈縮窄法誘導(dǎo)大鼠后壓力超負(fù)荷所致MF模型，探討其血漿中AngⅡ表達(dá)的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 雄性SD大鼠30只，體重180～200 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。飼養(yǎng)環(huán)境(22±2)℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。即用型血管緊張素Ⅱ放免試劑盒購自北京海瑞生物工程公司，放免測定在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院放免中心完成。

1.2 分組及模型制備 SD大鼠隨機(jī)取14只作為假手術(shù)組，余為模型組。模型組根據(jù)Doering等的方法，參照其腹主動(dòng)脈縮窄法，用3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常規(guī)消毒，分層打開腹腔，在左腎上緣分開后腹膜等軟組織，暴露腹主動(dòng)脈并在雙腎動(dòng)脈上方分離腹主動(dòng)脈，用銀夾造成腹主動(dòng)脈部分狹窄(銀夾內(nèi)徑0.7mm)分層關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組只打開腹腔、分離腹主動(dòng)脈，不用銀夾縮窄。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI):左心室與室間隔的重量(濕重)為左心室重量，用上海精科天平廠生產(chǎn)的JA1003型電子天平稱重。左心室重量(mg)/體重(g)為LVMI(‰)。

1.3.2 左心室心肌病理形態(tài)HE染色:左心室心肌常規(guī)石臘切片采用HE染色，經(jīng)過脫臘、染色、脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片等步驟，在光鏡下觀察左心室心肌組織病理形態(tài)改變。

1.3.3 AngⅡ放免測定:腹主動(dòng)脈取血3 ml，迅速注入冰水冷卻的抗凝管(10%EDTA二鈉)中搖勻，即刻再放回冰水浴中冷卻，4℃ 1000 r/min，離心5 min，分離血漿。血漿 －70℃保存。測定時(shí)冰凍標(biāo)本在流動(dòng)的冷水浴中快速融化，在冰水浴中，加樣操作后，3500 r/min，離心15 min，吸棄上清，測定各管沉淀的放射性(cpm)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后模型組死亡6只，8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束剩10只，死亡率為37.5%(6/16)。假手術(shù)組死亡2只，8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束剩12只;8周死亡率14.3%(2/14)。

2.2 LVMI 腹主動(dòng)脈縮窄大鼠造模8周(模型組)時(shí)LVMI為(2.91±0.32)‰較假手術(shù)組(2.10±0.12)‰顯著升高(P＜0.01)。

2.3 左心室心肌病理形態(tài)HE染色 光鏡下可見假手術(shù)組造模8周時(shí)左心室心同HE染色改變基本一致，心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞大小、形態(tài)正常。模型組造模8周左心室心肌病理形態(tài)HE染色顯示，心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞橫徑增大。見圖 1、2。

圖1 假手術(shù)組左心室心肌造模8周時(shí)(HE×100)

圖2 模型組左心室心肌造模8周時(shí)(HE×100)

2.4 血漿AngⅡ濃度的改變 造模8周時(shí)模型組血漿AngⅡ濃度為(640±220)pg/ml，較假手術(shù)組(419±76)pg/ml顯著升高(P ＜0.01)。

3 討論

AngⅡ是RAS系統(tǒng)的重要的生物活性肽，在多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。病理?xiàng)l件下，多種因素可誘導(dǎo)腎素釋放增加，作用于血管緊張素原，使其生成10肽化合物AngⅠ;AngⅠ可在多種酶作用下轉(zhuǎn)化為AngⅡ。傳統(tǒng)多認(rèn)為ACE途徑是AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ的主要途徑。糜蛋白酶是一種儲存的惰性糜蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶，Bacani等［1］認(rèn)為糜蛋白酶可不依賴血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的合成AngⅡ，這一途徑脈管損傷后糜蛋白酶釋放入間質(zhì)立即啟動(dòng)，并且糜蛋白酶在間質(zhì)組織中AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ方面占主要優(yōu)勢。糜蛋白酶尚可促進(jìn)內(nèi)皮素1前體的成熟［2］，進(jìn)而影響心肌間質(zhì)改變。此外，AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ也可經(jīng)胰蛋白酶、激肽釋放酶、組織蛋白酶G的作用途徑完成，這一觀點(diǎn)解釋了臨床血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑應(yīng)用過程中出現(xiàn)的逃逸現(xiàn)象。

AngⅡ受體有AT1受體和AT2受體，AngⅡ的生理作用幾乎均由AT1受體介導(dǎo)，如血管收縮、醛固酮分泌、兒茶酚胺釋放、水鈉潴留、細(xì)胞增殖等。多數(shù)試驗(yàn)證實(shí)AT1受體抑制劑ARB可通過阻斷 RAS系統(tǒng)和其他旁路途徑生成的AngⅡ與AT1受體結(jié)合，阻斷導(dǎo)致MF的途徑，同時(shí)增加為AngⅡ與 AT2的結(jié)合，產(chǎn)生擴(kuò)張血管，刺激一氧化氮和前列環(huán)素的增加，并防止心肌及血管壁肥厚的作用，從而延緩心力衰竭的進(jìn)程。厄貝沙坦通過阻滯AngⅡ受體，減少醛固酮分泌和交感神經(jīng)的活性，改善心功能、能量代謝及毛細(xì)血管再生，抑制膠原的形成和改善MF［3］。但Varagic等［4］研究顯示ARB可改善鹽相關(guān)心腎的功能和結(jié)構(gòu)異常而不降低血壓，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示AngⅡ(通過AT1受體)可能部分參與鹽負(fù)荷獨(dú)立壓力作用所致高血壓靶器官損害。AT2受體分布較AT1廣泛但目前對其功能了解不完全，大多認(rèn)為可對抗AT1受體效應(yīng)，如擴(kuò)張血管、抑制生長、產(chǎn)生凋亡等。Jiang等［5］研究顯示AT2受體可通過調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原和金屬蛋白酶組織抑制劑－1(TIMP1)mRNA水平影響心肌成纖維細(xì)胞的膠原代謝，從而發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)MF作用。自20世紀(jì)80年代起，人們發(fā)現(xiàn)除循環(huán)中的RAS外，在許多組織如心臟、血管、腦、腎等組織中也發(fā)現(xiàn)有腎素、Ang、ACE mRNA的表達(dá)，提示尚存在局部組織的RAS。雖然局部組織RAS各組分既可從血漿中攝取，也可在局部產(chǎn)生，但是局部組織的RAS生成及清除AngⅡ時(shí)，其酶學(xué)特征(底物濃度、動(dòng)力學(xué))與血漿中RAS不同。Yamamoto等［6］研究顯示ACE2的缺失能促進(jìn)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟功能障礙，這一過程通過增加局部AngⅡ完成，說明心血管組織中的RAS在高血壓、心血管重塑等的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。另外，新提出的腦RAS概念包括ACE2、AngⅠ～Ⅶ、腎素原和mas受體，RAS轉(zhuǎn)基因鼠腎素和血管緊張素原的過復(fù)制顯示腦RAS的重要性，腦中腦腎素原生成的AngⅡ可發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，可調(diào)控交感神經(jīng)活性和壓力反射［7］，進(jìn)而影響心臟負(fù)荷甚至心肌重塑的進(jìn)程。

MF是心室重塑的重要表現(xiàn)，是各種心血管疾病共有的進(jìn)程，研究MF模型具有重要的意義。MF作為一種病理學(xué)改變，存在于高血壓及心力衰竭等慢性心血管疾病模型進(jìn)程中。本研究顯示，造模8周時(shí)模型組左心室質(zhì)量指數(shù)較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.01);左心室心肌病理形態(tài)HE染色心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞橫徑增大，較假手術(shù)組變化明顯，符合心肌纖維化細(xì)胞外基質(zhì)改變。近來發(fā)現(xiàn)，CCN家族與心血管疾病有密切關(guān)系，現(xiàn)在普遍接受的是CCN蛋白并非生長因子，而是其他分子的修飾蛋白，尤其與細(xì)胞外基質(zhì)代謝密切相關(guān)［8］。CCN蛋白參與有絲分裂、吸附、細(xì)胞程序性凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)生成、增長、停止，甚至多種細(xì)胞型的遷移。心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均表達(dá)CCN1，而CCN1表達(dá)又受機(jī)械應(yīng)力、缺血、缺氧刺激以及神經(jīng)體液因子如AngⅡ與腎上腺素等誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。目前CCN家族被認(rèn)為是多種疾病新的有效治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床研究意義。

本研究顯示造模8周時(shí)模型組血漿AngⅡ水平較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.01)，提示大鼠腹主動(dòng)脈縮窄所致心臟后負(fù)荷的高壓力可能通過提高血漿AngⅡ水平而發(fā)揮促進(jìn)MF的作用。這一過程中，心肌細(xì)胞和基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑，心肌僵硬度增高，左心室心肌中AT1受體蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變，進(jìn)一步提高AngⅡ的敏感性。AngⅡ在其中發(fā)揮重要作用，可通過TGF/Smad、NF－κB、cAMP、cGMP 及 CCN 等途徑促進(jìn)核內(nèi)膠原mRNA表達(dá)，導(dǎo)致心肌中膠原沉積及比例改變，最終導(dǎo)致MF。因此，探討AngⅡ及相關(guān)因子參與MF機(jī)制，對深入認(rèn)識AngⅡ在心肌細(xì)胞外基質(zhì)改變及心血管系統(tǒng)基質(zhì)信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控中的作用具有重要意義。

1 Bacani C，F(xiàn)rishman WH.Chymase:a new pharmacologic target in cardiovascular disease.Cardiol Rev，2006，14:187－193.

2 D’Orleans Juste P，Houde M，Rae GA，et al.Endothelin－1(1－31):from chymase－dependent synthesis to cardiovascular pathologies.Vascul Pharmacol，2008，49:51－62.

3 黃嵐.厄貝沙坦對老年高血壓左心室肥厚的作用.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2007，20:218－219.

4 Varagic J，F(xiàn)rohlich ED，Susic D，et al.AT1 receptor antagonism attenuates target organ effects of salt excess in SHRs without affecting pressure.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294:H853－858.

5 Jiang XY，Gao GD，Du XJ，et al.The signalling of AT2 and the influence on the collagen metabolism of AT2 receptor in adult rat cardiac fibroblasts.Acta Cardiol，2007，62:429－438.

6 Yamamoto K，Ohishi M，Katsuya T，et al.Deletion of angiotensin converting enzyme 2 accelerates pressure overload induced cardiac dysfunction by increasing local angiotensin II.Hypertension，2006，47:718－726.

7 Phillips MI，de Oliveira EM.Brain renin angiotensin in disease.J Mol Med，2008，86:715－722.

8 Yeger H，Perbal B.The CCN family of genes:a perspective on CCN biology and therapeutic potential.J Cell Commun Signal，2007，1:159－164.