付世新 ，夏成 ，李鵬 ，沈冰蕾，王長遠(yuǎn)

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院）

銅是動物和人不可缺少的微量元素之一，體內(nèi)含量過多或者缺乏都可引起機(jī)體代謝發(fā)生紊亂而發(fā)生疾病。養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)，在畜禽日糧中添加或靜脈注射適量的銅可促生長，可提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[1]。但有關(guān)銅促生長的作用機(jī)理仍然不清，尤其是有關(guān)銅代謝轉(zhuǎn)運(yùn)過程的研究也比較少見，銅特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctr是銅離子攝入蛋白，Ctr1蛋白在Ctr1-5等5種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中轉(zhuǎn)運(yùn)銅的能力最強(qiáng)，它是銅進(jìn)入細(xì)胞的主要傳送蛋白[2，3]，其表達(dá)量的多少直接關(guān)系到機(jī)體銅代謝的平衡，是研究銅如何進(jìn)行代謝和促生長作用的關(guān)鍵所在[4]。通過在PK15細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的銅，來分析Ctr1基因mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)主要含銅酶超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性變化的相關(guān)性，探討銅代謝機(jī)理，為以后防治人和動物疾病及動物飼料添加劑的研制提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

豬傳代腎細(xì)胞PK15（本實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.2 試劑

國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純CuSO4，胰蛋白酶、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基購于hyclone公司、無血清液體營養(yǎng)基購于Gibco公司，含銅 0.002 mg·L-1、L-谷氨酰氨和犢牛血清購于北京鼎國生物技術(shù)公司、Olig dT、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ，反轉(zhuǎn)錄酶AMV、Olig dT、焦磷酸二乙酯（DEPC）、DNA質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T載體購于TaKaRa公司;總RNA提取試劑盒購于QIAGEN公司;RT-PCR試劑盒,購自Promega公司;DNA回收試劑盒購于杭州維特杰生物技術(shù)公司;超氧化物歧化酶檢測試劑盒購于南京建成生物工程公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)Genbank中登錄的Ctr1基因mRNA序列,設(shè)計(jì)Ctr1和β-actin的引物。Ctr1基因目的片段大小為530 bp，β-actin大小目的片段大小為321 bp。兩對引物分別如下：

2 方法

2.1 Ctr1基因的克隆[5]

2.1.1 cDNA合成及PCR反應(yīng)

提取PK15細(xì)胞的總RNA，并以O(shè)lig dT為引物進(jìn)行RT-PCR，獲得cDNA。進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min，94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72℃溫育10min。

雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。

各組總RNA的提取同上，取等量的mRNA用Olig dT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA備用。取1 μL各組cDNA為模板，采用β-actin作為內(nèi)參，對Ctr1基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，重復(fù)5次,拍照后經(jīng)軟件分析計(jì)算密度比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

依據(jù)直線擬方程擬合得到的品位—噸位模式為：y＝-1015.6X+7666.5，擬合值與原始值相關(guān)系數(shù)R2=0.8369（圖7）

2.2 不同銅濃度對Ctr1基因mRNA表達(dá)量的影響

依那西普聯(lián)合環(huán)磷酰胺對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎合并間質(zhì)性肺炎患者相關(guān)指標(biāo)的影響 ………………………… 陳良敏等（2）：236

超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法（采用南京建成生物工程公司試劑盒）。

2.2.2 Ctr1基因mRNA表達(dá)水平的檢測[6]

藍(lán)寶石也稱“剛玉”，英文叫做“Sapphire”，它的由來有各種說法。有的說源自于梵語“Sauriratna”（魔玉的寶石），有的說是源自阿拉伯海上一個島嶼的名字——Sapphirine。

2.2.1 分組

用1%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物并回收，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化連到pMD18-T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑法篩選出陽性菌落,用DNA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。HindⅢ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒。電泳觀察酶切結(jié)果,鑒定為陽性菌株送上海生工測序。

本項(xiàng)是一個兜底條款。除了上述規(guī)定的權(quán)利外，評估專業(yè)人員在評估活動中還享有相關(guān)法律、行政法規(guī)規(guī)定的其他權(quán)利。值得注意的是，按照權(quán)利法定的原則，評估專業(yè)人員的權(quán)利只能由法律、行政法規(guī)授予，地方性法規(guī)、規(guī)章無權(quán)授予。法律是指全國人民代表大會及其常務(wù)委員會制定的法律規(guī)范的總稱。行政法規(guī)是指國務(wù)院根據(jù)憲法和法律，按照法定程序制定的有關(guān)行使行政權(quán)力，履行行政職責(zé)的規(guī)范性文件的總稱。

2.3 細(xì)胞內(nèi)銅離子含量測定

2.3.1 細(xì)胞分組和收集

m,andm,respectively.Set the viscous friction factor as l=50.The parameters for PD control are kp=1 and kd=1.8.

目的片段擴(kuò)增結(jié)果見圖1。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果分別為530 bp和320 bp左右的片段,與設(shè)計(jì)的片段大小相符。

2.3.2 樣品檢測

取處于對數(shù)生長期的PK15細(xì)胞,接種于6孔培養(yǎng)板上，37℃、5%CO2培養(yǎng)，10 h后更換尤無血清液體培養(yǎng)基2.85mL和150 μL 5種濃度的硫酸銅組成的 混 合 液 。 銅 濃 度 分 別 為 0、7.8、15.6、31.2、62.5 μmoL·L-1（根據(jù)生產(chǎn)實(shí)踐數(shù)據(jù)確定的實(shí)驗(yàn)梯度），編號為實(shí)驗(yàn)Ⅰ組到實(shí)驗(yàn)Ⅴ組。9 h后，收取各組細(xì)胞提取總RNA提取，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.組織載體 通過從教工黨員中選拔骨干教師擔(dān)任教研室主任，將教工黨支部服務(wù)關(guān)口前移，增加黨務(wù)與業(yè)務(wù)的有效距離，為全面實(shí)施特色教工黨支部建設(shè)提供了重要的組織載體。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果和分析

3.1 Ctr1基因及β-actinRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

細(xì)胞分組同上，于添加銅后10 h細(xì)胞收集和計(jì)數(shù)。用胰酶消化5～7min，細(xì)胞計(jì)數(shù)取相同細(xì)胞數(shù)后離心，再用PBS將每個樣品沖洗3次，洗去細(xì)胞表面吸附的銅離子。溶于420 μL蒸餾水中，超聲波破碎，待檢。

3.2 Ctr1基因的酶切鑒定結(jié)果

2.1.2 Ctr1基因的克隆

用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切PMD-Ctr1質(zhì)粒，凝膠電泳顯示一條530 bp左右的片段，大小與Ctr1基因相符。經(jīng)比對同源性達(dá)到98%。

3.3 銅對Ctr1基因mRNA表達(dá)水平的影響

RT-PCR檢測Ctr1基因mRNA表達(dá)水平的變化表1。

圖1 Ctr1基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of RT-PCR product of Ctr1 gene

圖2 PMD-Ctr1質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Result of PMD-Ctr1 by double enzyme restriction analysis

表1 不同添加銅濃度Ctr1基因mRNA表達(dá)量(±SD)Table 1 Expreesion of Ctr1 gene mRNA effected by copper concentration(±SD)

表1 不同添加銅濃度Ctr1基因mRNA表達(dá)量(±SD)Table 1 Expreesion of Ctr1 gene mRNA effected by copper concentration(±SD)

注：同一列標(biāo)有不同字母表示差異顯著（p<0.05）

銅濃度/μmoL·L-1 07.815.631.262.5 Ctr1表達(dá)密度值/ng 14.55±0.153a 11.15±0.224ab 7.88±0.172bc 9.93±0.382c 4.76±0.26a β-actin表達(dá)密度值/ng 39.64±1.2439.07±2.0240.02±1.5638.98±1.6139.48±2.14 Ctr1/β-actin 值0.367±0.12a 0.285±0.11ab 0.196±0.11bc 0.255±0.24c 0.121±0.12a

從以上結(jié)果可以看出，β-actin的表達(dá)差異較小，保持均衡不變，加入不同濃度銅后，Ctr1基因mRNA的表達(dá)各實(shí)驗(yàn)組間存在顯著差異，對照組表達(dá)量居首，其他組表達(dá)量依次為實(shí)驗(yàn)Ⅱ組、Ⅴ組、Ⅲ組、Ⅳ組，實(shí)驗(yàn)Ⅲ組明顯低于實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組（P<0.05），而與Ⅳ組間差異不顯著。

3.4 培養(yǎng)液中添加銅對細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性的影響

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性見表2。

表2 添加不同銅濃度對CuZn-SOD活性的影響(±SD)Table 2 Effection of CuZn-SOD activity in cell by copper concentration in media(±SD)

表2 添加不同銅濃度對CuZn-SOD活性的影響(±SD)Table 2 Effection of CuZn-SOD activity in cell by copper concentration in media(±SD)

注：同一列標(biāo)有相同字母表示差異不顯著（p>0.05）同一列標(biāo)有不同字母表示差異顯著（p<0.05）

細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性見表2。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性顯著高于對照組（P<0.05）。其中以添加31.2 μmoL·L-1Cu實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性最強(qiáng)，添加15.6 μmoL·L-1Cu組次之。加入銅后10 h各實(shí)驗(yàn)組CuZn-SOD活性高于對照組。加入銅后16 h，31.2 μmoL·L-1Cu 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi) CuZn-SOD 活性顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）。加入銅后20 h，15.6 μmoL·L-1Cu 組和 31.2 μmoL·L-1Cu 組顯著高于其它組（P<0.05）。加入銅后24 h，各實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，細(xì)胞表面Ctr1基因mRNA的表達(dá)量與細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性呈反向性。

4 討論

Ctr1是位于哺乳動物的細(xì)胞膜上高結(jié)合力的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Ctr1在細(xì)胞代謝中發(fā)揮著非常重要的作用，是調(diào)節(jié)細(xì)胞銅代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，該蛋白含量或者Ctr1mRNA的表達(dá)量直接關(guān)系到細(xì)胞銅代謝的穩(wěn)定，從而影響機(jī)體代謝機(jī)能。研究表明酵母處于低銅狀況時，由于負(fù)反饋?zhàn)饔弥潦笴tr1蛋白的含量升高，而濃度處于0.1～1 μmoL·L-1范圍時，換言之處于非中毒銅狀態(tài)，該蛋白表達(dá)量隨銅濃度變化升降不明顯，但銅離子濃度超過10 μmoL·L-1時，Ctr1蛋白表達(dá)量則呈現(xiàn)減少趨勢，轉(zhuǎn)運(yùn)銅的能力降低，細(xì)胞則采取吞飲的方式將銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)[7]。這說明，銅水平課調(diào)控Ctr1蛋白表達(dá)量，缺乏時可促進(jìn)該蛋白的表達(dá)，過量則出現(xiàn)Ctr1表達(dá)抑制。具體是在mRNA表達(dá)過程中還是在翻譯過程中增多或減少了Ctr1蛋白的表達(dá)量，迄今還沒有一個明確的說法，可能同時是存在某些調(diào)控Ctr1蛋白基因的轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)。同時，在細(xì)胞膜上Ctr1蛋白是如何將銅轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)作機(jī)制還尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

一是進(jìn)一步加強(qiáng)市場和疫情預(yù)警信息，引導(dǎo)養(yǎng)殖戶加強(qiáng)生產(chǎn)管理，防控疫??；二是加強(qiáng)市場監(jiān)管，打擊屠宰企業(yè)壓價行為，減少養(yǎng)殖戶損失；三是推廣疫病保險，減少養(yǎng)殖戶的損失，如安華保險推出非洲豬瘟保險（育肥豬和母豬分別支付保費(fèi)5元和10元/頭，賠付500元和1000元）；四是強(qiáng)化疫區(qū)尤其是主產(chǎn)區(qū)屠宰能力，減緩疫情發(fā)生時出欄壓力；五是完善調(diào)運(yùn)監(jiān)管方案，通過大區(qū)域劃分等形式實(shí)現(xiàn)種豬和仔豬的點(diǎn)對點(diǎn)調(diào)運(yùn)，保障生豬生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

針對以上問題對Ctr1基因mRNA表達(dá)對不同銅濃度的反應(yīng)進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Ctr1基因mRNA表達(dá)受銅離子濃度的調(diào)控，在0～62.5 μmoL·L-1Cu濃度范圍內(nèi)時，呈雙相表達(dá)反應(yīng)。與細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性檢測結(jié)果比較，兩者呈明顯的反相關(guān)系，由此可以推斷，銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 mRNA表達(dá)水平的減少，可導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成也隨之減少，從而引起細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子的數(shù)量減少，減少了細(xì)胞中毒的可能,對細(xì)胞產(chǎn)生了保護(hù)性作用。實(shí)驗(yàn)Ⅴ組的結(jié)果表明，當(dāng)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 mRNA表達(dá)量回升時，細(xì)胞內(nèi)的CuZn-SOD活性卻反而降低了。這些與劉國文等[8]報道的結(jié)果一致，當(dāng)培養(yǎng)液中銅濃度添加到62.5 μmoL·L-1時，軟骨細(xì)胞細(xì)胞骨微絲、微管、強(qiáng)力纖維均發(fā)生不同程度的損傷變形。這個添加濃度導(dǎo)致Ctr1 mRNA表達(dá)水平提高是否與骨架結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，還需進(jìn)一步探討。

［1］吳建設(shè)，楊漢春，周毓平，等.微量元素銅在動物機(jī)體內(nèi)的代謝研究進(jìn)展［J］.飼料博覽，1998，(10)：11-12.

［2］付世新，羅春海，劉海瑞.銅對豬傳代腎細(xì)胞(PK15)增殖的影響［J］.黑龍八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2008，(2)：47-50.

［3］付世新，張利，齊長學(xué)，等.銅對Ctr1基因mRNA表達(dá)的影響［J］.黑龍八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2009，(12)：29-32.

［4］Jaekwon Lee,Joseph R,Prohaska.Essential role for mammalian copper transporter Ctr1 in copper homeostasis and embryonic development［J］.Proc Natl Acad Sci USA.2001，98，（12）:6842-6847.

［5］金東雁，黎孟楓.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京：科學(xué)出版社，2002.

［6］陳高明，王白鳳，李春海.復(fù)合定量PCR檢測谷光甘肽-S轉(zhuǎn)移酶和多藥耐藥相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平方法的建立和初步應(yīng)用［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，1999，17（4）：179-199.

［7］Yuko Yamaguchi-Iwai,Mihaela Serpe,David Haile,et al.Homeostatic regulation of copper up take in yeast via direct binding of MAC1 protein to upstream regulatory sequences of FRE1 and CTR1［J］.JBC,1997,272(28):17711-17718.

［8］劉國文，周昌芳，張乃生，等.銅對體外仔豬軟骨細(xì)胞增殖和自分泌 IGF-Ⅰ、IGFBP3的影響［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2002，（9）:515-517.