王喬飛
(江蘇江山制藥有限公司,江蘇靖江 214500)
多維片是綜合營(yíng)養(yǎng)保健品,其成份極其復(fù)雜,不但包括各種水溶性和脂溶性維生素,還有多種補(bǔ)充的微量元素,其中VD3是一種脂溶性維生素,其含量極低,樣品中僅約含2.5ug/g,且性質(zhì)不穩(wěn)定,遇光和空氣均易變質(zhì)、降解,而且其它雜質(zhì)對(duì)其穩(wěn)定性和檢測(cè)都有影響和干擾,其含量測(cè)定一直是個(gè)瓶頸難題。
有關(guān)資料提供的方法,主要采用添加堿液進(jìn)行皂化反應(yīng),然后采用石油醚、乙醚多次萃取,再用氮?dú)饬鞔蹈商幚?。不但操作過(guò)程繁瑣,而且樣品的回收率不穩(wěn)定,操作的重現(xiàn)性很差。有的方法在對(duì)樣品中VD3充分溶出作了考慮,但在處理過(guò)程中缺少抗氧、防吸附,減少干擾等措施,致使成分仍有損失而回收率偏低。有文獻(xiàn)報(bào)道,采用反相色譜系統(tǒng)測(cè)定,但對(duì)于脂溶性維生素采用反相系統(tǒng),樣品回收率不滿意。
本文提供了一個(gè)實(shí)用、易操作的檢測(cè)方法,無(wú)需進(jìn)行皂化處理和反復(fù)萃取等繁瑣操作,而是針對(duì)VD3性質(zhì)不穩(wěn)定,制劑成分復(fù)雜的情況,分別采取了避光、抗氧,抗干擾分離手段,取得了較好效果。特別適用痕量VD3的準(zhǔn)確測(cè)定。該方法未見報(bào)道。
Agilent 1200 HPLC系統(tǒng),配紫外檢測(cè)器。
色譜柱:菲羅門luna 5um silica柱 250*4.6 mm;流動(dòng)相:異丙醇:正己烷(0.5:99.5);流速:2 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):264 nm;進(jìn)樣體積:75 uL。
對(duì)照品:VD3:USP standance,Cat no:13100,Lot:MOB157
試劑:正己烷、異丙醇、二甲亞砜為色譜純;氯化鈉、抗壞血酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(APDC)為分析純。
對(duì)照品貯備溶液:精密稱取60.0mg±0.1mg維生素D3對(duì)照品于一250ml棕色容量瓶中,立即用正己烷溶解并稀釋至刻度,此溶液濃度為0.24mg/ml。
對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液用正己烷溶劑再分步稀釋500倍后,得對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。
樣品溶液制備:取5g APDC和1 g抗壞血酸,溶于1000mL DMSO中,具塞,避光保存,作為萃取溶液;取20片樣品磨細(xì),精密稱取約5.0g細(xì)粉于一200mL棕色具塞錐形瓶中,加25mL萃取液,上述溶液于超聲水浴機(jī)中60±3℃超聲15min,取出放冷至室溫,加入25.0mL正己烷,強(qiáng)烈振搖,再加15mL18%NaCl溶液,緩緩搖動(dòng),具塞放冷。高速渦旋混勻約5min,再靜置5min,吸取上層液體于一50mL離心管中,高速離心約5min,取正己烷上清液過(guò)濾后注入HPLC液相色譜儀。
分別制備對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液,各取75μL注入液相色譜儀,分別記錄對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖(如下圖所示),結(jié)果VD3和其它雜質(zhì)峰的分離度大于2.0,理論板數(shù)按VD3峰計(jì)算大于2500,表明該系統(tǒng)適應(yīng)性良好。
圖1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
圖2 樣品溶液色譜圖
精密稱取維生素D3對(duì)照品,配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μg/mL 的溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,色譜峰面積分別為:9.40,18.64,37.81,57.30,75.77。對(duì)照品峰面積與進(jìn)樣濃度作線性方程:A=97.521C-0.191,C 表示濃度,單位:mg/mL。(n=5,r=0.9999),樣品溶液濃度范圍為0.1 ~0.8μg/mL。其關(guān)系如圖3。
圖3 工作曲線
2.4.1 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)
取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,分別為:48.2,48.3,48.2,48.0,46.7,47.7,計(jì)算精密度,平均峰面積為 47.85(n=6,RSD=1.26%)。
2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)
取本品,照樣品溶液制備方法處理,進(jìn)行含量測(cè)定,重復(fù)測(cè)定6次,峰面積分別為53.86,53.25,53.66,53.45,54.07,53.59。平均峰面積為 53.59(n=6,RSD=0.62%)。重復(fù)性試驗(yàn)表明,本法的重復(fù)性較好。
2.4.3 中間精密度試驗(yàn)
在不同時(shí)間,由化驗(yàn)室同事照同法操作,用美國(guó)Waters 600液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),記錄色譜圖,計(jì)算VD3平均含量,得VD3平均含量為2.540 ug/g,RSD 為 0.41%。
取2.4.2 項(xiàng)下樣品溶液,在 0h、1h、2h、4h、6h、8h時(shí)各進(jìn)樣一次,記錄色譜圖,得VD3峰面積的RSD為0.36%,但雜質(zhì)峰的總峰面積在6小時(shí)后有所增加。
分別制備含80%,100%,120%維生素D3的樣品,測(cè)試回收率。結(jié)果見表1。
表1 樣品回收率結(jié)果
在配方量的80% ~120%范圍內(nèi),測(cè)定平均回收率為99.04%,RSD 為1.11%(n=9),說(shuō)明該測(cè)定方法準(zhǔn)確度較好。
由于產(chǎn)品中VD3含量很低,能將其充分溶解出來(lái)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵,本法采用萬(wàn)能溶劑二甲亞砜,并進(jìn)行超聲水浴處理,保證其充分溶出。
針對(duì)VD3遇氧不穩(wěn)定,準(zhǔn)確測(cè)量痕量VD3含量,提高其回收率,關(guān)鍵是處理過(guò)程中要增加穩(wěn)定手段,同時(shí),由于組分復(fù)雜,為減少干擾損失,須采取適當(dāng)?shù)姆蛛x方法。為此,本法采取了以下措施方法:(1)加入少量抗壞血酸酸抗氧化降解;(2)加入吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(APDC)對(duì)雜質(zhì)離子進(jìn)行絡(luò)合,防干擾;(3)加入氯化鈉溶液,使高分子絮凝,減少吸附損失;(4)采用正已烷對(duì)其充分萃取,起到較好的抗氧化保護(hù)作用。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)顯示:VD3在低于80℃時(shí),對(duì)熱穩(wěn)定。故本法可采用60℃水浴加熱。
由于VD3對(duì)光照不穩(wěn)定,因此,在整個(gè)操作過(guò)程中均用棕色容器,避光操作。
本法測(cè)定復(fù)雜組分中的痕量VD3含量,操作簡(jiǎn)便易行,方法重現(xiàn)性好,回收率基本接近100%,結(jié)果準(zhǔn)確。
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