向 軍, 孫 珍, 徐正鵬, 夏俊星, 郇京寧

近年來,大面積燒傷并發(fā)侵襲性真菌感染有明顯上升趨勢。侵襲性真菌感染主要與念珠菌和曲霉相關(guān),而曲霉感染比例日益增加。臨床上診斷真菌感染的方法主要由宿主因素、臨床特征、微生物學(xué)檢查和組織病理學(xué)4部分組成。由于燒傷患者真菌感染的臨床表現(xiàn)不具有特異性,呼吸道和血培養(yǎng)標(biāo)本真菌培養(yǎng)陽性率低,早期診斷非常困難[1]。半乳甘露聚糖(GM)是曲霉細(xì)胞壁上的一種多聚抗原,體內(nèi)循環(huán)中GM檢測較臨床癥狀和影像學(xué)異常出現(xiàn)前數(shù)天表達(dá)陽性,其靈敏度和特異度均可達(dá)到80%以上。GM試驗是當(dāng)前比較標(biāo)準(zhǔn)的用于檢測曲霉的方法,可以作為篩選指標(biāo)之一,其連續(xù)檢測,有助于早期診斷曲霉感染并及時用藥[2]。但目前GM試驗的臨床界值尚未確定。本研究通過早期對大面積深度燒傷患者血清GM的動態(tài)檢測,并結(jié)合臨床診斷,初步探索燒傷患者曲霉感染的GM界值,為燒傷臨床早期診斷提供依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

選擇2008年6月—2009年5月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷科住院燒傷患者,以單次檢測吸光度(A)指數(shù)＞0.5為入選標(biāo)準(zhǔn),總計20例男性患者,平均年齡(33±11)歲,燒傷面積40%～95%,燒傷深度均為深度燒傷(深Ⅱ度至Ⅲ度)。所有患者入院后每周采血2次、共3周,共收集血標(biāo)本120份。

二、方法

(一)血清GM測定 研究患者采血后24 h內(nèi)離心分離出血清,-20℃凍存。GM測定采用Platelia Aspergillus試劑盒(Bio-Rad公司產(chǎn)品)。具體方法 ：300 μ L 血清與100 μ L 處理液混勻,100 ℃水浴3 min后以10 000 r/min離心10 min,取上清液待測;在96孔板中,每孔加結(jié)合液50 μ L和處理后的血清50 μ L(其中4孔為標(biāo)準(zhǔn)參照),封口,37℃水浴90 min,去封口膜,清洗、拍板循環(huán)5次,每孔吸干后加入顯色液200 μ L,室溫避光 30 min 后加終止液 100 μ L,在450 nm波長的酶標(biāo)儀上讀取A指數(shù)。

(二)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考2008年歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)共識組的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。確診侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)要求穿刺或活檢獲取無菌組織標(biāo)本,經(jīng)顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)菌絲或培養(yǎng)出霉。燒傷外科專業(yè)侵襲性真菌感染診斷意見參照《現(xiàn)代燒傷治療》[4],主要包括：真菌自燒傷創(chuàng)面侵入,穿透到焦痂下并侵入鄰近活組織;口腔黏膜培養(yǎng)到真菌,同時胃腸道黏膜下感染灶真菌培養(yǎng)陽性而兩者菌種一致者;真菌菌血癥伴有臟器轉(zhuǎn)移。對大面積深度燒傷患者而言,臨床上無法獲取無菌標(biāo)本組織,所以我們將檢測對象分3類,擬診病例、疑似病例和非曲霉感染病例。擬診病例：患者至少符合1項宿主因素、1項臨床標(biāo)準(zhǔn)和1項微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。疑似病例：至少符合1項宿主因素、1項臨床標(biāo)準(zhǔn),但無微生物學(xué)證據(jù)?；颊叨ㄆ谧鰟?chuàng)面、氣道分泌物、中段尿和血液的曲霉培養(yǎng),并行X線胸片檢查。對擬診和疑似病例進(jìn)行抗真菌藥物治療,并繼續(xù)監(jiān)測血清GM的變化。

(三)統(tǒng)計學(xué)分析 以擬診病例和疑似病例為陽性組,非曲霉感染病例為陰性組作四格表分析。GM試驗的靈敏度與特異度、陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值的計算公式如下：靈敏度(SEN)=a/(a+c)、特異度(SPE)=d/(b+d)、陽性預(yù)測值=a/(a+b)、陰性預(yù)測值=d/(c+d)。根據(jù)GM試驗的 A值,設(shè)定0.5、1.0和 1.5共 3個界限,并分單次和連續(xù) 2次測定值,分別進(jìn)行統(tǒng)計。并計算假陽性率[特異度=1-假陽性率=1-b/(b+d)]、假陰性率[靈敏度=1-假陰性率=1-c/(a+c)]。

結(jié) 果

一、臨床的診斷結(jié)果

根據(jù)2008年EORTC/MSG共識組的診斷標(biāo)準(zhǔn),同時參考燒傷專業(yè)的診斷意見,以及患者臨床表現(xiàn)、創(chuàng)面與體液真菌培養(yǎng)、影像學(xué)檢查的結(jié)果,本研究中有擬診病例3例、疑似病例4例,其余13例則排除曲霉感染。

二、患者GM檢測分布范圍

根據(jù)血清GM試驗A指數(shù)設(shè)定的3個界限：0.5、1.0和1.5,并分單次和連續(xù)2次測定值,擬診病例、疑似病例和非曲霉感染病例的GM檢測分布范圍見表1。

表1 血清GM試驗結(jié)果分布Table 1.Distribution of GM test results

三、血清GM試驗的統(tǒng)計結(jié)果

根據(jù)不同評估界限,血清GM試驗的靈敏度與特異度、陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值的統(tǒng)計結(jié)果,見表2。

表2 血清GM試驗的統(tǒng)計結(jié)果Table 2.Analysis of sensitivity,specificity,positive and negative predictive values

四、A指數(shù)單次≥1.5者與臨床曲霉感染陰性表現(xiàn)

納入研究的20例患者中,單次A指數(shù)≥1.5且沒有明確臨床感染跡象者有3例,其中1例單次A指數(shù)達(dá)1.93。這3例患者均未發(fā)現(xiàn)曲霉感染臨床征象,且實驗室、影像學(xué)檢查也不支持曲霉感染。根據(jù)靈敏度與特異度的統(tǒng)計結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)A指數(shù)單次≥1.5的假陽性率為37%,假陰性率為14%;連續(xù)2次≥1.5的假陽性率為 10%,假陰性率為29%。

五、連續(xù)檢測GM值與療效的關(guān)系

對擬診和疑似的7例患者進(jìn)行抗曲霉藥物治療,6例有效,1例死亡。在GM的連續(xù)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn),死亡患者的血清GM值持續(xù)處于高水平,而抗曲霉治療有效的患者血清GM值呈明顯下降趨勢。

討 論

隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素等的廣泛應(yīng)用以及器官移植、導(dǎo)管留置操作的普及,真菌感染的發(fā)病率不斷升高。真菌感染主要與念珠菌和曲霉相關(guān),兩者占真菌感染的90%左右,而近期曲霉感染的發(fā)生率有穩(wěn)定上升的趨勢。曲霉感染的臨床表現(xiàn)多樣,其中尤為重要的類型是侵襲性曲霉病。侵襲性曲霉病指曲霉侵入人體組織、血液,并在其中生長繁殖引起組織損害、器官功能障礙和炎癥反應(yīng)的病理改變及病理生理過程,其特征為曲霉菌絲侵襲血管,需要及時診斷和早期積極有效的應(yīng)用抗真菌藥物。大面積深度燒傷患者,由于機(jī)體免疫力下降、防御功能嚴(yán)重受損、長時間使用廣譜抗生素、創(chuàng)面壞死組織的存在等因素,曲霉感染的發(fā)生率很高[5]。燒傷后的曲霉感染有其特點(diǎn)[4],首先從有大量壞死組織的創(chuàng)面定植開始,然后穿透焦痂侵入皮下脂肪,侵犯靜脈和淋巴管,進(jìn)入血液后引起侵襲性感染,并在創(chuàng)面局部引起血栓形成、創(chuàng)面加深、肌肉壞死,對機(jī)體危害甚大。一旦發(fā)生了侵襲性曲霉感染,抗真菌藥物的療效將會大大降低,導(dǎo)致高病死率[6]。因此,對曲霉感染的早期診斷和及時藥物治療,與患者預(yù)后直接相關(guān)。

臨床上常用檢驗真菌的方法,包括體液或創(chuàng)面的真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、影像學(xué)檢查等,對燒傷患者,臨床意義均不大。創(chuàng)面病理活檢或培養(yǎng),由于標(biāo)本不是無菌組織,檢測結(jié)果也不能明確診斷。與血液病、腫瘤、肺部疾病并發(fā)真菌感染不同,大面積燒傷患者發(fā)生真菌感染,臨床征象上一般無特異表現(xiàn),同時其血象變化、影像學(xué)資料包括X線胸片也多數(shù)不具備診斷特征,并常為原發(fā)病所掩蓋。曲霉的培養(yǎng)結(jié)果往往需要等待1～2周,而血培養(yǎng)的陽性率極低,而且陽性者標(biāo)本污染的可能性較大。即使創(chuàng)面曲霉培養(yǎng)陽性,也無法區(qū)分是局部定植、還是侵襲性感染。曲霉病藥物治療的最佳時機(jī)在于感染早期,而目前燒傷臨床上,由于診斷方法有限、擔(dān)心延誤治療時機(jī)等原因,多數(shù)患者的抗真菌治療依然只能憑臨床經(jīng)驗,而經(jīng)驗性治療的療效僅為40%～50%,往往會造成治療不足或過度治療[7]。

血清學(xué)檢測方法是近年來發(fā)展較快的能早期檢驗真菌感染手段之一。GM試驗是一種通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中曲霉半乳甘露聚糖抗原以協(xié)助診斷真菌感染的方法,其靈敏度為50%～90%,特異度為80%～90%。這項檢測已被美國FDA和歐洲許多國家批準(zhǔn)用于血液、腫瘤等免疫受損者中侵襲性真菌感染的診斷[8]。研究證實,ELISA法檢測GM對診斷曲霉病具有較高的特異度;同時,有2/3患者在臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)出現(xiàn)之前數(shù)天至1周,ELISA法測定的血清GM即可以獲得陽性結(jié)果,對高危患者連續(xù)動態(tài)監(jiān)測(每周2次)具有早期診斷的價值,并證實監(jiān)測血清GM含量動態(tài)變化同樣有利于治療效果和病情發(fā)展的判斷[9]。但問題是其靈敏度報道差異很大,在30%～100%,主要原因之一是所采取的檢測界值不同。目前關(guān)于血清GM檢測界值尚存爭論。臨床上常用ELISA法,試劑盒為Platelia Aspergillus。同樣的試劑與方法測定曲霉抗原,不同國家和地區(qū)判定的界值尚不統(tǒng)一,歐洲多采用1.0或1.5的界值標(biāo)準(zhǔn),且連續(xù)2次陽性提示血清GM陽性;而2003年美國FDA將界值下調(diào)至0.5,雖然靈敏度有一定提高,但是0.5～1.5之間的可疑陽性范圍給診斷帶來很大的差異。血清GM試驗用于燒傷伴曲霉感染的診斷和治療評估還剛起步,對燒傷患者來講,明確其診斷界值十分重要,因此,我們做了這方面的初步探索。在患者人選上,我們把具有宿主高危因素的大面積深度燒傷患者納入本研究;并依據(jù)美國FDA的界值標(biāo)準(zhǔn),將單次A指數(shù)＞0.5作為入選條件。

通過對20例、單次A指數(shù)＞0.5的大面積深度燒傷患者,每周2次、共3周動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)：連續(xù)2次≥1.0,靈敏度71%,特異度 73%;連續(xù) 2次 ＞1.5,靈敏度71%,特異度90%;而相對應(yīng)地,單次≥1.0,靈敏度86%,特異度 54%;單次＞1.5,靈敏度86%,特異度63%。同時,通過對試驗的陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值進(jìn)行統(tǒng)計比較,結(jié)合燒傷伴曲霉感染的臨床特點(diǎn)等多方面因素分析,初步發(fā)現(xiàn),對大面積燒傷患者而言,GM試驗陽性值界定為連續(xù)2次A指數(shù)≥1.5的臨床參考價值較大。本研究還發(fā)現(xiàn),納入研究的患者中,單次A指數(shù)＞1.5且沒有臨床感染跡象者有3例,這些患者也沒有曲霉感染實驗室依據(jù),提示有一定的假陽性。假陽性主要見于以下情況：標(biāo)本被青霉屬、鐮刀霉、毛霉等污染,接受哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-克拉維酸等青霉素類抗生素治療,許多食物尤其是牛奶制品中含有半乳甘露聚糖,均可引起假陽性。此外,由于曲霉釋放入血漿中的GM不是持續(xù)存在而是會被很快清除,成為造成假陰性的原因之一,多次復(fù)查可以提高檢出率[10]。血清GM動態(tài)檢測還發(fā)現(xiàn),應(yīng)用抗曲霉的藥物治療后,治療有效患者的GM值呈明顯的下降趨勢,無效者則持續(xù)高表達(dá),從而提示GM 的動態(tài)檢測,對燒傷曲霉感染患者的治療療效評估有一定意義。

本研究結(jié)果提示,動態(tài)檢測血清GM抗原水平變化,對于大面積燒傷患者伴曲霉感染的早期診斷具有重要意義,且連續(xù)2次血清A指數(shù)≥1.5的臨床參考價值較大。由于本研究的樣本量偏小,進(jìn)一步大樣本的調(diào)查、分析是必要的;同時,對于抗真菌治療過程中,GM 值變化對藥物療效的評估價值,也尚需更多的臨床資料和分析。

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