李 娜， 戴美學(xué)

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014）

植物內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，一旦進(jìn)入植物體內(nèi)，即可獨(dú)立繁殖和傳遞，并占據(jù)有利的生態(tài)位點(diǎn)來防止病原菌的入侵［1］。因此有益的內(nèi)生細(xì)菌有可能成為生物防治中很有發(fā)展?jié)摿Φ纳酪蜃印?/p>

草莓灰霉病是導(dǎo)致草莓產(chǎn)量和質(zhì)量降低的主要限制因素之一［2］。目前，對草莓灰霉病的防治以化學(xué)手段為主，但研究表明隨著灰霉抗性菌株的增加，化學(xué)防治的優(yōu)勢正在下降［3－4］，且存在農(nóng)藥殘留問題［5］。因此安全、低毒的生物防治已成為研究的熱點(diǎn)，作為生物制劑的木霉和酵母菌已在灰霉病的防治中發(fā)揮重大作用［6－7］。研究證明生物制劑如能阻止或減少灰霉菌對于草莓花朵的侵染，就能有效地控制灰霉病害［8］，而內(nèi)生細(xì)菌能發(fā)揮該項(xiàng)作用。

草莓內(nèi)生細(xì)菌具有通過產(chǎn)生吲哚乙酸和溶解有機(jī)磷來促進(jìn)植株生長的作用［9］，但對其生防作用的研究國內(nèi)外尚未有報道。本文對防治草莓灰霉病菌的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選，并對一株高效菌株SL6進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

董家草莓基地3個大棚中生長旺盛的草莓，在不同層次，不同區(qū)域以五點(diǎn)取樣法取草莓根、莖、葉。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000mL，pH 自然；NA：牛肉膏3.5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g、水1 000mL，pH7.0～7.2。

1.1.3 靶標(biāo)病原菌

草莓灰霉病菌（BotrytiscinereaPers.ex Fr.），本試驗(yàn)室保存菌種。

1.1.4 引物

16SR1（AGAAAGGAGGTGATCCAGCC）；16SF1（AGAGTTTGATCC TGGCTCAG）由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 草莓內(nèi)生菌的分離

1.2.1.1 表面消毒時間的選擇

為了既能保證植物組織的青翠，以獲得較多的內(nèi)生菌，又能保證表面消毒徹底，需要通過一系列試驗(yàn)尋找恰當(dāng)?shù)腍gCl2消毒時間。將草莓根、莖、葉用0.1%HgCl2處 理1、1.5、2、2.5、3、3.5、4min。然后將處理后的根、莖、葉在NA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，觀察是否有菌的生長。

1.2.1.2 表面消毒

將植物組織用清水沖洗干凈，無菌水沖洗10次，在75%乙醇中消毒5min，無菌水沖洗3次，最佳0.1%HgCl2時間消毒后，無菌水沖洗3次。

1.2.1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離

將檢出的消毒徹底的組織采用五點(diǎn)取樣法剪成0.5cm×0.5cm左右的小塊，組織勻漿器研磨充分，依次稀釋，取原液、10－1、10－2、10－3稀釋度的組織液0.1mL涂布于NA平板，每種樣品3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～5d。

1.2.1.4 內(nèi)生細(xì)菌的純化

培養(yǎng)3～5d后，挑取不同形態(tài)的菌落于NA平板上畫線純化。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選與拮抗性能測定

1.2.2.1 草莓灰霉菌拮抗菌的篩選

采用對峙培養(yǎng)法，取直徑8mm的靶標(biāo)菌菌餅置于PDA平板（d＝90mm）中央，用接種環(huán)挑取純化好的菌種點(diǎn)接在距平板中央3cm處的4個角點(diǎn)上，25℃培養(yǎng)7d后測量抑菌帶寬。每處理設(shè)3個重復(fù)。選出對病原菌生長有抑制作用，且被抑病原菌絲邊緣平齊、拮抗作用持久的菌株。

1.2.2.2 拮抗菌株的拮抗性能測定

進(jìn)入復(fù)篩的菌株，按上述方法做對峙試驗(yàn)，以接種靶標(biāo)菌餅的平板做對照，每處理設(shè)3個重復(fù)，25℃培養(yǎng)3～5d，直到對照平板布滿灰霉菌，測量抑菌圈半徑（細(xì)菌菌落中心至病原菌菌絲邊緣）。

1.2.2.3 SL6發(fā)酵濾液的抑菌作用測定

抑菌效果最佳的SL6菌株在37℃振蕩培養(yǎng)3d后，發(fā)酵液離心（12 000r／min，20min），取上清液用細(xì)菌過濾器（0.25μm）除菌，得無菌發(fā)酵液，取1mL發(fā)酵濾液加入到熔化的25mL PDA培養(yǎng)基中，混勻后制平板，以不加發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基為對照。同步接種草莓灰霉病菌菌絲塊，每個處理重復(fù)3次，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照板菌絲觸及平板邊緣開始測量，計(jì)算加入濾液的平板菌絲生長直徑的平均值，利用公式可得出其抑菌率。對無菌發(fā)酵濾液進(jìn)行梯度稀釋后，同樣方式，測其稀釋后的抑菌率。挑取經(jīng)過濾液處理及對照平板上的邊緣菌絲，在掃描電鏡下觀察菌絲形態(tài)。

抑菌率＝（對照板菌絲直徑一處理板菌絲直徑）／（對照板菌絲直徑一霉菌菌塊初始直徑）×100%。

1.2.3 拮抗細(xì)菌的初步鑒定

根據(jù)拮抗細(xì)菌菌株的形態(tài)、培養(yǎng)性狀和生理生化特性的測定結(jié)果，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進(jìn)行鑒定［10－11］。

1.2.4 拮抗細(xì)菌的分子鑒定

抽提拮抗菌總DNA，利用16SrDNA細(xì)菌通用引物R1和F1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收，送至上海生工生物科技公司測序。測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較。

1.2.5 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從GenBank中查找已經(jīng)測序的同屬菌的16S rDNA序列用ClustalX進(jìn)行多序列比對分析，再用MEGA4軟件中Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次Bootstraps檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 選擇HgCl2消毒時間

由表1可以看出，草莓根、莖、葉所需的0.1%HgCl2最佳消毒時間不同，根部所需處理時間最長，需3.5min。葉所需時間為3min，莖部需要2.5min，這可能與植物各個器官的生理結(jié)構(gòu)相關(guān)。

2.2 各組織中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量

由表2可知，草莓的各個組織結(jié)構(gòu)中均有內(nèi)生細(xì)菌定殖，但不同組織中內(nèi)生細(xì)菌分布的密度不同，草莓莖部內(nèi)生細(xì)菌的含量為2.29×104～3.95×104cfu／g鮮重，葉中為3.22×103～9.66×103cfu／g鮮重，草莓根部的內(nèi)生細(xì)菌的含量最少，為2.8×101～5.3×101cfu／g。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及分離部位的不同，共純化得內(nèi)生細(xì)菌54株。且不同組織結(jié)構(gòu)中內(nèi)生菌的種類也不相同，莖中分得形態(tài)顏色不同的菌株27株，葉中15株，根中12株?？梢姡瑑?nèi)生細(xì)菌的分布密度及種類均與所在植物的部位相關(guān)。

表2 草莓不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的含量

2.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的抑菌效果及形態(tài)學(xué)和生理生化特性的鑒定

2.3.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的拮抗能力測定

平板對峙試驗(yàn)測定結(jié)果表明，5株內(nèi)生細(xì)菌具有較為明顯的拮抗作用，抑菌半徑最低為7mm，最高的SL6可達(dá)15mm（表3、圖1）。

表3 5株內(nèi)生拮抗菌株的抑菌能力1）

2.3.2 SL6發(fā)酵濾液的拮抗作用

通過對于生長直徑的測量，運(yùn)用公式得出，SL6的發(fā)酵濾液對草莓灰霉病菌菌絲的抑制率達(dá)97.6%（圖2）。稀釋100倍后，抑菌率為53.7%，有較好的抑菌效果（圖3）。掃描電鏡下對混有發(fā)酵液及空白對照平板上菌絲的形態(tài)觀察顯示，對照菌絲光滑、修長，濾液處理組菌絲部分膨大變形甚至斷裂，原生質(zhì)體溢出（圖4）。與平板對峙試驗(yàn)中，對菌絲的作用一致。推測是活性物質(zhì)的溶菌作用所致。具體的活性物質(zhì)成分還有待于進(jìn)一步的研究。

圖1 SL6抑菌效果

圖2 SL6無菌發(fā)酵液的拮抗活性檢測

圖3 SL6無菌發(fā)酵液稀釋后的抑菌效果

2.3.2 拮抗內(nèi)生菌的形態(tài)學(xué)和生理生化測定結(jié)果

通過形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征的測定，對草莓灰霉病菌有抗菌作用的5株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果見表4、5。

表4 5株內(nèi)生拮抗菌形態(tài)及染色特征

表5 5株內(nèi)生拮抗菌生理生化測定結(jié)果1）

圖4 SL6無菌發(fā)酵液對菌絲的抑制作用

5株菌株幼齡培養(yǎng)物均成桿狀，革蘭氏陽性，芽胞為卵圓球形，以周生鞭毛運(yùn)動，好氧或兼性厭氧，革蘭氏陽性，接觸酶反應(yīng)呈陽性，不產(chǎn)生吲哚，確定其均歸屬于芽胞桿菌屬（Bacillussp.）［10－11］。

2.3.3 菌株SL6系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株SL6的16SrDNA PCR產(chǎn)物長度為1 487bp，此序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊序列號為FJ948786.1。由構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，SL6與芽胞桿菌屬的菌株同源性高，與枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）DCC1106（EU276080）在同一分支上，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，可鑒定菌株SL6為枯草芽胞桿菌。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

3 討論

內(nèi)生細(xì)菌定殖在植物的內(nèi)部［12］，通常能夠促進(jìn)植物的生長，且不會對植物的組織器官造成傷害［13］，是植物組織內(nèi)的正常菌群，可以通過組織學(xué)方法或從表面嚴(yán)格消毒的植物組織和汁液中分離獲得［14］。本研究表明，草莓根、莖、葉組織中均存在大量內(nèi)生細(xì)菌，各組織內(nèi)生細(xì)菌的密度不同，范圍在2.8×101～3.95×104cfu／g鮮重之間。

圖5 菌株SL6的系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究通過設(shè)計(jì)不同的梯度來確定升汞的最佳消毒時間，以達(dá)到使分離的內(nèi)生細(xì)菌盡可能真實(shí)地反映植物內(nèi)的微生物群落的效果。過長的消毒時間導(dǎo)致內(nèi)生細(xì)菌種群密度減少；消毒時間較短，附生細(xì)菌會干擾內(nèi)生細(xì)菌密度的計(jì)算；且不同組織器官，因其構(gòu)造的不同，需要的消毒時間也會有差異。

內(nèi)生菌種有很多抗性菌株，具有提取各種抗菌物質(zhì)的潛力［15－16］，是生物防治中起重要作用的生防因子。目前，從植物內(nèi)部分離得到的生防細(xì)菌已有多種，如：王書同從番茄植株中分離得到一株內(nèi)生枯草芽胞桿菌對番茄灰霉病菌的抑制率達(dá)71.1%［17］，但對草莓內(nèi)生細(xì)菌生防作用的研究，目前國內(nèi)外尚未報道，本研究從草莓中篩選得到內(nèi)生枯草芽胞桿菌SL6，其無菌發(fā)酵液對草莓灰霉病菌的抑制率可達(dá)97.6%，具有生防菌的潛能。對其發(fā)酵濾液進(jìn)行分析可知是抗菌蛋白在起作用，但分離純化的方法有待進(jìn)一步研究，以期得到在病害生物防治中能起作用的抗菌蛋白。

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