馮 源， 祖艷群， 陳海燕， 李 元

（云南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明 650201）

在過去30多年間，隨著工業(yè)的發(fā)展，大量氯氟烴類合成物、氮氧化合物等向大氣逸散，致使平流層中臭氧層的破壞不斷加速，導致到達地表的UV－B輻射（280～320nm）顯著增加［1］。雖然 UV－B輻射在太陽短波輻射中所占量較小，但卻能有效地被一些生物大分子，如核酸、蛋白質等物質吸收，從而對生物造成傷害。UV－B輻射不僅對植物、動物及人類產(chǎn)生顯著影響，也會導致微生物數(shù)量和生命活動發(fā)生明顯變化。UV－B輻射可影響植物病原菌的生長發(fā)育、生理生化特性，導致植物病原菌對植物的致病力發(fā)生改變，從而間接影響植物病害嚴重度及病害循環(huán)過程［2］。UV－B輻射增強對植物病菌生長、生理及致病力等方面的顯著影響已在煙草苷菌（Plectosporiumalismatis）［3］、西瓜炭疽病菌（Colletotrichumorbiculare）［4］等病菌的研究中得到證實。而且，同植物一樣，病菌也表現(xiàn)出不同的UV敏感性差異［5］。

燈盞花［Erigeronbreviscapus（Vant.）Hand.－Mazz.］是菊科飛蓬屬多年生草本植物，以全草入藥，具有散寒解表、活血舒筋、止痛、消積等功效［6］。近年來，隨著大面積的人工栽培，燈盞花葉斑病日益嚴重。對云南省幾個主要的燈盞花栽培區(qū)進行調查結果表明，鏈格孢菌［Alternariaalternata（Fr.）Keissler］為燈盞花葉斑病的致病菌［7］。目前，國內外對于鏈格孢菌的研究報道較多，多偏重于分類和系統(tǒng)發(fā)育研 究［8－9］，有的已深 入 到 分子水平［10－11］，而對于鏈格孢菌的UV光生物學研究較少。本文首次將環(huán)境因子UV－B輻射與燈盞花葉斑病致病菌——鏈格孢菌相聯(lián)系，研究UV－B輻射增強對該菌生長、生理及致病力的影響，初步探討鏈格孢菌對UV－B輻射增強的響應機制，為燈盞花綠色無污染防病技術的完善與發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

2007－2008年的6－9月，在云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司的燈盞花繁育基地進行燈盞花葉斑病的病情調查。同時，采集受害植株樣本，于實驗室內進行病原真菌的分離、純化及種類鑒定。根據(jù)病菌的形態(tài)特征及柯赫氏法則的致病性檢驗，并參照《真菌鑒定手冊》［12］與《中國真菌志第十六卷鏈格孢屬》［13］，確 定 其 為 鏈 格 孢 菌 ［Alternariaalternata（Fr.）Keissler］。

1.2 UV－B輻射處理

模擬UV－B輻射使用40WUV－B燈管（280～320nm，上海），燈管用0.08mm乙酸纖維素膜包被，以去除小于290nm的短波輻射。用紫外輻射儀（北京師范大學光電儀器廠生產(chǎn)）測定UV－B輻射強度。設3個 UV－B輻射水平：0、5.0、10.0kJ／m2；3個 UV－B輻射處理時間：0、40、60min。根據(jù)培養(yǎng)皿與燈管之間的高度調節(jié)UV－B輻射強度。每處理5個重復。

用滅菌打孔器（d＝6mm）在已活化的鏈格孢菌菌落邊緣打取菌餅，接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中央，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。之后，將敞開蓋的培養(yǎng)皿置于UV－B燈管正下方，對鏈格孢菌進行UV－B輻射處理。輻射前，預開紫外燈30min，使其穩(wěn)定。用滅菌打孔器（d＝6mm）從經(jīng)UV－B輻射處理過的菌落上打取菌餅，接入PDA培養(yǎng)基中央，用黑布包裹培養(yǎng)皿防止光復活，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。

1.3 菌絲生長率測定與形態(tài)觀察

分別在UV－B輻射后培養(yǎng)第1、3、5、7天按照十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長率（%），并記錄菌落形態(tài)變化。挑取培養(yǎng)7d的鏈格孢菌菌絲，于干凈的載玻片上，加蒸餾水用蓋玻片蓋緊，于40倍顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.4 產(chǎn)孢量測定

用血球計數(shù)法［14］測定經(jīng)UV－B輻射處理后培養(yǎng)7d的鏈格孢菌的產(chǎn)孢量。產(chǎn)孢量標準如下：100～102個／mL為稀少、103～105個／mL為中等、106～108個／mL為豐富，分別以“＋、＋＋、＋＋＋”表示。

1.5 菌絲干重測定

用滅菌打孔器（d＝6mm）從經(jīng)UV－B輻射處理過的菌落上打取菌餅，每個100mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中放入1塊菌餅，置于25℃，140r／min條件下，每日定時振蕩3次，每次2h，避光培養(yǎng)。培養(yǎng)7d后，培養(yǎng)液用已知重量的干燥定量濾紙過濾，最后于（80±2）℃烘干，測定菌落干重。同時，分別在培養(yǎng)后第1、3、5、7天取培養(yǎng)液，用2層無菌紗布過濾。濾液在3 000r／min離心20min，取上清液即粗酶液，置于4℃冰箱中保存，進行酶活測定。

1.6 纖維素酶活性測定

參考Abu－Sarra［15］的測定方法。以葡萄糖為材料繪制標準曲線（y＝0.989 5x＋0.027，R2＝0.989 6）。反應體系包括0.5mL粗酶液和1.5mL的0.05mol／L檸檬酸緩沖液（含有0.5%羧甲基纖維素鈉，pH＝4.8），50℃下反應30min后，立即加入1.5mL二硝基水楊酸試劑（DNS）。反應液置于沸水浴中反應5min，冷卻后加0.5mL去離子水，在540nm波長處測定吸光值。根據(jù)葡萄糖標準曲線計算生成的還原糖濃度。以上述反應條件下1min生成1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位（U），用U／mg·min表示。

1.7 過氧化氫酶（CAT）活性測定

參考 Aebi的測定方法［16］，反應液體系包括30μL粗酶液、1.5mL 10mmol／L 磷酸緩沖溶液（pH＝7.6）和1mL 20mmol／L H2O2，在240nm波長處測定吸光值。以上述反應條件下每min吸光值變化0.1為一個酶活單位（U），用 U／mg·min表示。

1.8 可溶性蛋白含量測定

參考Bardford［17］的測定方法。以牛血清白蛋白為材料繪制標準曲線（y＝0.434 5x－0.014 3，R2＝0.997）。反應體系包括0.5mL粗酶液和5mL考馬斯亮藍G－250蛋白質染色液，反應15min后，在595nm波長處測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白質含量（mg／mL）。

1.9 致病力測定

接種材料為云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司燈盞花繁育基地的燈盞花栽培品種。挑選具10～15片真葉、長勢一致、健壯的燈盞花苗進行接種試驗。用滅菌打孔器（d＝6mm）在UV－B輻射處理后的鏈格孢菌菌落上打取菌餅，貼附在燈盞花的葉片中央。每片葉接種1塊菌餅，每株接種8片葉。每處理3個重復，每重復測定10株。植株接種后置于25℃下，套袋保濕培養(yǎng)24h。之后，除去保濕袋，繼續(xù)培養(yǎng)7d后測定病斑直徑。

燈盞花葉斑病分級標準參考小麥鏈格孢葉枯病的病害分級［18］：0級，無癥狀；1級，病斑直徑≤2mm；2級，病斑直徑2.1～4mm；3級，病斑直徑4.1～7mm；4級，病斑直徑7.1～11mm；5級，病斑直徑11mm以上。

1.10 統(tǒng)計分析

采用SPSS11.0軟件，進行顯著性差異分析（Duncan 檢 驗，p＜0.05）。 利 用 Excel（Office 2003）軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 鏈格孢菌菌落及菌絲形態(tài)的變化

經(jīng)不同UV－B輻射處理過的鏈格孢菌在7d后的菌落形態(tài)變化見圖1。經(jīng)UV－B輻射增強處理的鏈格孢菌菌絲分布變得致密、緊湊；氣生菌絲大量減少；黑色素增多，菌落顏色加深，逐漸變?yōu)楹诤稚痪渥儽　?/p>

圖1 經(jīng)不同UV－B輻射處理的鏈格孢菌菌落形態(tài)變化

UV－B輻射增強對鏈格孢菌的菌絲形態(tài)可產(chǎn)生顯著影響。如圖2b所示，經(jīng)UV－B輻射處理后的鏈格孢菌菌絲內顆粒狀沉積物質增多，菌絲體變粗，顏色加深，菌絲表面凸凹不平，呈結節(jié)狀。而正常生長的菌絲均勻透明，呈珊瑚狀，細長而平滑（圖2a）。

圖2 UV－B輻射增強對鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響（40×）

2.2 鏈格孢菌菌絲生長率的變化

表1顯示經(jīng)UV－B輻射處理后1～7d內鏈格孢菌的菌絲生長變化。UV－B輻射增強導致菌絲生長明顯滯后，對照組病菌的菌絲生長率最大值出現(xiàn)在輻射后培養(yǎng)第5天，而經(jīng)UV－B輻射處理過的病菌菌絲生長率峰值出現(xiàn)在輻射后培養(yǎng)第7天。經(jīng)UV－B輻射處理后1～5d內，隨UV－B輻射增強，菌絲生長率顯著下降（p＜0.05）。在UV－B輻射后培養(yǎng)第7天，5.0kJ／m2輻射強度處理過的鏈格孢菌的菌落直徑同對照之間沒有顯著差異（p＞0.05），而高強度的 UV－B輻射（10.0kJ／m2）處理后的病菌菌落直徑則顯著下降（p＜0.05）。同一UV－B輻射強度下，20～60min的輻射時間對菌絲生長的影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。

表1 UV－B輻射對鏈格孢菌菌絲生長率的影響1）

2.3 鏈格孢菌菌絲干重與產(chǎn)孢量的變化

由表2可知，隨UV－B輻射強度的增加，鏈格孢菌的菌絲干重顯著增加（p＜0.05）；病菌產(chǎn)孢量明顯下降。同一UV－B輻射強度下，20～60min的處理時間對鏈格孢菌菌絲干重與產(chǎn)孢量的影響沒有顯著差異（p＞0.05）。

2.4 鏈格孢菌纖維素酶活性的變化

在UV－B輻射增強條件下，病菌纖維素酶活性顯著下降（p＜0.05）（表3）。隨處理后培養(yǎng)時間的延長，病菌纖維素酶活性逐漸升高。在處理后培養(yǎng)第7天，5.0kJ／m2強度處理過的鏈格孢菌纖維素酶活性同對照之間沒有顯著差異（p＞0.05），經(jīng)10.0kJ／m2強度處理過的病菌酶活顯著降低（p＜0.05）。同一UV－B輻射強度下，經(jīng)20～60min的輻射處理，病菌酶活沒有顯著變化（p＞0.05）。

表2 UV－B輻射對鏈格孢菌菌絲干重與產(chǎn)孢量的影響1，2）

表3 UV－B輻射對鏈格孢菌纖維素酶活性的影響1）

2.5 鏈格孢菌過氧化氫酶（CAT）活性的變化

鏈格孢菌CAT活性表現(xiàn)出與纖維素酶活性不一致的UV－B輻射增強響應（表4）。隨UV－B輻射強度的增加，病菌CAT活性顯著升高（p＜0.05）。隨處理后培養(yǎng)時間的延長，病菌CAT活性表現(xiàn)出先上升后下降的變化規(guī)律，對照組酶活則持續(xù)升高。經(jīng)10.0kJ／m2強度處理的病菌酶活高峰出現(xiàn)在處理后第3天；經(jīng)5.0kJ／m2強度處理的鏈格孢菌CAT活性高峰出現(xiàn)處理后第5天。在處理后第7天，鏈格孢菌的CAT活性與對照之間沒有顯著差異（p＞0.05）。同一UV－B輻射強度下，20～60min的輻射處理對鏈格孢菌的CAT活性沒有顯著影響（p＞0.05）。

表4 UV－B輻射對鏈格孢菌CAT活性的影響1）

2.6 鏈格孢菌可溶性蛋白含量的變化

如表5所示，UV－B輻射增強條件下，鏈格孢菌可溶性蛋白含量顯著降低（p＜0.05）。隨處理后培養(yǎng)時間的延長，病菌可溶性蛋白含量逐漸升高，但始終低于對照水平（p＜0.05）。在處理后培養(yǎng)第5天，5.0kJ／m2與10.0kJ／m2輻射強度處理后的病菌可溶性蛋白含量之間沒有顯著差異（p＞0.05）。同一 UV－B輻射強度下，經(jīng)20～60min的輻射處理，鏈格孢菌的可溶性蛋白含量未發(fā)生顯著變化（p＞0.05）。

表5 UV－B輻射對鏈格孢菌可溶性蛋白含量的影響1）

2.7 鏈格孢菌致病力的變化

用經(jīng)UV－B輻射增強處理過的鏈格孢菌進行人工接種試驗，結果表明，燈盞花葉斑病的病情指數(shù)隨UV－B輻射增強而顯著下降（p＜0.05）（圖3）。這表明UV－B輻射增強導致鏈格孢菌的致病力顯著下降。同一UV－B輻射強度下，對鏈格孢菌進行20～60min的輻射處理，對病菌的致病力沒有顯著影響（p＞0.05）。

圖3 UV－B輻射增強對燈盞花葉斑病病情指數(shù)的影響

3 結論與討論

3.1 UV－B輻射增強對鏈格孢菌生長、生理及致病力的影響及機理

本試驗發(fā)現(xiàn)，UV－B輻射增強可延緩鏈格孢菌的菌絲生長，導致病菌菌落及菌絲形態(tài)顯著改變，菌落直徑及產(chǎn)孢量顯著下降。在對番茄早疫病菌（Alternariasolani）［19］、禾旋孢腔菌（Cochliobolussativus）［20］等病菌的研究中也得到了相似的結論。鏈格孢菌的纖維素酶活性、CAT活性及可溶性蛋白含量均產(chǎn)生不同程度的UV－B輻射增強響應。UV－B輻射對病菌生理生化特性的影響是導致其生長發(fā)生顯著變化的主要原因之一［21］。纖維素酶是植物病菌重要的胞壁降解酶之一，鏈格孢菌纖維素酶活力的減弱也會對病菌的致病力產(chǎn)生顯著的影響。鏈格孢菌CAT活性的變化是UV－B輻射下活性氧積累所致，鏈格孢菌的UV－B輻射損傷可能與活性氧引起的氧化脅迫有關［22］。紫外線作為誘變劑主要對生物大分子DNA產(chǎn)生誘變作用，造成基因突變，這必然影響蛋白質的合成，引起蛋白質含量的變化［21］。UV－B輻射增強對鏈格孢菌的生長及生理的損害作用是導致病菌致病力顯著下降的主要原因。

病菌對UV－B輻射的響應同時受UV－B輻射強度與輻射時間兩因素的影響，相同波長的UV－B作用效應主要取決于其劑量率（單位時間內的UV－B輻射強度）［22］。UV－B輻射對病菌的作用具有一定的累積效應，只有當劑量率達到或超過一定的閾值，UV－B輻射對鏈格孢菌的損傷效應才表現(xiàn)出顯著的變化。而且，這也同鏈格孢菌自身的UV－B敏感性有關［2］。

3.2 鏈格孢菌對UV－B輻射增強的響應機制

鏈格孢菌采取形態(tài)學上的變化來抵御UV－B輻射增強的傷害。病菌通過改變菌落面積與菌絲密度，促進菌絲內顆粒狀沉積物的分泌，增加菌絲干重，來調節(jié) UV－B輻射對其的穿透力［22－23］。在逆境中，黑色素化的細胞壁層是病菌與環(huán)境間的一道屏障。病菌通過在體內合成大量黑色素來有效地吸收紫外光，將光能量轉移到其分子結構中，使細胞免受紫外光的傷害［24］。UV輻射主要通過促進黑色素合成基因的表達與轉錄，來調控病菌體內黑色素的合成［25］。

同植物一樣，病菌也會產(chǎn)生生理生化上的適應機制，來抵御UV－B輻射的傷害。UV－B輻射增強導致鏈格孢菌體內CAT活性顯著上升，清除體內活性氧自由基，降低UV－B造成的光氧化傷害。病菌抗氧化酶活性的變化與UV－B劑量率呈正相關［22］。病菌的DNA在受到UV－B損傷的同時，也在進行自我修復。從鏈格孢菌的菌絲生長率、纖維素酶及CAT活性的時間變化可以看出，經(jīng)UV－B輻射后予以一定的恢復時間，鏈格孢菌的生長及其生理活性均有一定程度的提高。鏈格孢菌對低UV－B輻射強度（5.0kJ／m2）損傷的自我修復作用更為明顯。

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