孟程程,孫曉鳳,張 莉,閆佩瑤,于金鳳

山東省小麥莖基腐病的病原鑒定

孟程程,孫曉鳳*,張 莉,閆佩瑤,于金鳳**

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 山東 泰安 271018

為明確山東小麥莖基腐病的病原組成及優(yōu)勢(shì)菌群，本研究自山東省濟(jì)南、泰安、德州、濰坊、煙臺(tái)、聊城、菏澤、臨沂等8個(gè)地區(qū)，共采集200余份小麥莖基腐病發(fā)病樣本，分離獲得224個(gè)菌株，從中選取190個(gè)代表性菌株，對(duì)其EF-1α序列進(jìn)行分析，鑒定其所屬類群并測(cè)定不同病原菌的致病性。結(jié)果表明：190個(gè)菌株中包含142株假禾谷鐮孢菌（）、35株禾谷鐮孢菌()、6株輪枝鐮孢菌()和7株層出鐮孢菌()，假禾谷鐮孢菌占鑒定菌株的74.7%，是山東省小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌。致病性測(cè)定結(jié)果表明，分離得到的不同種鐮孢菌均對(duì)小麥植株具有致病力，但假禾谷鐮孢菌致病力最強(qiáng)。

小麥莖基腐病; 病原菌; 假禾谷鐮孢菌; 致病性

小麥莖基腐病（Wheat Crown Rot）是一種典型的土傳性真菌病害，該病害最早報(bào)道于澳大利亞[1]，之后在亞洲[2-6]、非洲[7]、北美洲[8,9]、南美洲[10]以及大洋洲[11]等世界各小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生報(bào)道。該病害在小麥生長(zhǎng)全期均可發(fā)生，播種期侵染造成小麥爛種；苗期侵染使小麥莖基部腐爛，發(fā)病后期嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致小麥枯白穗，造成減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)[12]。

近年來，我國(guó)各地小麥莖基腐病發(fā)生頻繁，山東省小麥莖基腐病的發(fā)生也呈加重趨勢(shì)。病原菌鑒定對(duì)病害的防控十分重要，目前尚無對(duì)山東省小麥莖基腐病病原菌的系統(tǒng)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)山東省8個(gè)地區(qū)的小麥莖基腐病病菌進(jìn)行了分離鑒定，采集地基本涵蓋了不同小麥種植區(qū)，分離鑒定結(jié)果比較客觀地反映了小麥莖基腐病病原菌的組成，對(duì)山東省小麥莖基腐病的防治有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集小麥莖基腐病樣本采集自山東省濟(jì)南、德州、聊城、菏澤、泰安、濰坊、煙臺(tái)、臨沂等8個(gè)地區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基，用于病原菌的分離純化；CMC培養(yǎng)基，用于病原菌分生孢子的培養(yǎng)。

1.2 病原菌的分離

取病株莖基部發(fā)病部位剪成約0.5 cm的片段，0.1%升汞浸泡30 s，75%酒精浸泡30 s，無菌水漂洗3次，滅菌濾紙吸干表面水分后置于PDA培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，挑取新生菌落邊緣菌絲繼續(xù)純化培養(yǎng)，結(jié)合《常見鐮刀菌鑒定指南》[13]將具有鐮孢菌形態(tài)特征的菌株進(jìn)行保存。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定將純化的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，在智能光照培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)5~7 d，觀察菌落形態(tài)和色素產(chǎn)生情況；接種病原菌到100 mL CMC培養(yǎng)基中，25 ℃、160 rpm培養(yǎng)3 d，采用顯微鏡(尼康90i)觀察分生孢子及分生孢子梗形態(tài)。結(jié)合《常見鐮刀菌鑒定指南》對(duì)不同病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定EF-1α基因?qū)τ阽犳呔N級(jí)水平的區(qū)分鑒定具有有效性[14]，本研究采用CTAB法[15]提取供測(cè)菌株的基因組DNA。使用EF-1α基因序列特異性引物EF-1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)，EF-2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、10×EsayTaq 5 μL、dNTPs 4 μL、EasyTaq DNA Polymerase 1 μL，加ddH2O至50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 90 s，92 ℃ 30 s，55 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并送上海博尚生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.4 病原菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

依據(jù)測(cè)序結(jié)果，選取不同種鐮孢菌的代表菌株，使用MEGA5.1以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 病原菌的致病性測(cè)定

1.5.1 帶菌麥粒培養(yǎng)基的制備選取飽滿麥粒沸水煮至微微開裂，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中高溫蒸汽滅菌，隨機(jī)選取不同種鐮孢菌菌株接種滅菌麥粒，菌株編號(hào)分別為假禾谷鐮孢菌WHF104、禾谷鐮孢菌WHF57、輪枝鐮孢菌WHF203和層出鐮孢菌WHF149，25 ℃培養(yǎng)至菌絲布滿錐形瓶，取出帶菌麥粒晾干備用。

1.5.2 病原菌的接種溫室盆栽條件下，以濟(jì)麥22為試驗(yàn)材料，無菌水浸泡24 h催芽，將萌發(fā)麥粒與帶菌麥粒培養(yǎng)基一齊播種至育苗盆中，帶菌麥粒位于萌發(fā)種子下方1 cm處。共設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)播種5個(gè)麥粒，以不接種帶菌麥粒的小麥植株作為對(duì)照。

1.5.3 病情指數(shù)的計(jì)算接種30 d后對(duì)小麥植株發(fā)病情況調(diào)查，室內(nèi)盆栽小麥莖基腐病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)：整株無變褐癥狀；1級(jí)：植株僅第一葉鞘變褐，且變褐面積不超過1/2；3級(jí)：植株僅第一葉鞘變褐，且變褐面積超過1/2；5級(jí)：植株第二葉鞘變褐；7級(jí)：植株第三葉鞘變褐或植株死亡。

統(tǒng)計(jì)不同處理小麥莖基腐病發(fā)病級(jí)數(shù)并計(jì)算病情指數(shù)。利用DPS2000軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

病情指數(shù)=100×Σ（各級(jí)發(fā)病個(gè)數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總個(gè)數(shù)×最高級(jí)代表值）

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥莖基腐病病原的分子鑒定

從采集的小麥莖基腐病樣本中，共分離得到224個(gè)小麥莖基腐病菌株，并編號(hào)（見表1）。

表1 小麥莖基腐病病原菌的分離

根據(jù)菌落特征，選取190個(gè)代表菌株對(duì)其EF-1α基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得約710 bp大小的片段（見圖1）。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海博尚生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在Gen Bank中進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定其所屬種群（見表2）。

結(jié)果表明，190個(gè)菌株中有142株假禾谷鐮孢菌、35株禾谷鐮孢菌、6株輪枝鐮孢菌及7株層出鐮孢菌。假禾谷鐮孢菌占總體74.74%，為優(yōu)勢(shì)病原菌。不同地區(qū)均以假禾谷鐮孢菌為主要病原菌。從不同種鐮孢菌中隨機(jī)選取27個(gè)代表菌株，使用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。

圖2 基于EF-1α基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可以看出，假禾谷鐮孢菌與禾谷鐮孢菌之間親緣關(guān)系較近，層出鐮孢菌和輪枝鐮孢菌之間種間親緣關(guān)系較近；同種鐮孢菌的不同菌株也存在分支，這些分支與地理來源無明顯聯(lián)系，4種鐮孢菌均存在較明顯的遺傳分化現(xiàn)象，遺傳多樣性豐富。

2.2 小麥莖基腐病病原菌的形態(tài)特征

為進(jìn)一步獲得不同鐮孢菌的形態(tài)學(xué)特征，將4種鐮孢菌分別接種到PDA培養(yǎng)基和CMC培養(yǎng)基中，觀察不同種鐮孢菌的菌落形態(tài)、分生孢子和分生孢子梗形態(tài)（見圖3）。

圖3 四種鐮孢菌的菌落形態(tài)、分生孢子及分生孢子梗形態(tài)

注：A，E為假禾谷鐮孢菌菌落形態(tài)及分生孢子、分生孢子梗；B，F(xiàn)為禾谷鐮孢菌菌落形態(tài)及分生孢子、分生孢子梗；C，G為輪枝鐮孢菌菌落形態(tài)及分生孢子、分生孢子梗；D，H為層出鐮孢菌菌落形態(tài)及分生孢子、分生孢子梗。Bar=10 μm。

Note: These pictures showed that colony morphology, conidium and conidiophore in fourspp., A, E belong to; B, F belong to; C, G areand D, H are. Bar=10 μm.

如圖3所示，不同鐮孢菌菌落形態(tài)區(qū)別較為明顯，假禾谷鐮孢菌菌絲直立致密呈白色，中心菌絲為黃色，產(chǎn)紅色，黃色色素或不產(chǎn)色素，分生孢子多為大型分生孢子，鐮刀型，隔膜3~5個(gè)；禾谷鐮孢菌菌絲白色或黃色，產(chǎn)玫紅色或黃色色素，分生孢子多為大型分生孢子，鐮刀型，與假禾谷鐮孢菌不易區(qū)分，隔膜3~5個(gè)；輪枝鐮孢菌菌絲呈卷曲狀，中心菌絲為紫色，邊緣菌絲呈白色，產(chǎn)紫色色素，多為大型分生孢子，隔膜2~4個(gè)；層出鐮孢菌菌絲致密卷曲，產(chǎn)紫色、粉色色素或不產(chǎn)色素，分生孢子多為小型分生孢子，單隔或無隔。除假禾谷鐮孢菌外，其他3種鐮孢菌形態(tài)學(xué)特征符合《常見鐮刀菌鑒定指南》描述，假禾谷鐮孢菌與禾谷鐮孢菌在形態(tài)特征上比較相似，需輔助于分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

2.3 病原菌致病性的測(cè)定

以濟(jì)麥22為試驗(yàn)材料，測(cè)定不同種鐮孢菌對(duì)小麥植株的致病性（見表3）。

表3 不同鐮孢菌對(duì)小麥苗期植株的致病性測(cè)定

注：病情指數(shù)中字母相同表示差異未達(dá)顯著水平(>0.05)，字母不同表示差異達(dá)顯著水平(<0.05)。

Note: The same alphabets of disease index list shows no significance (>0.05), on the contrary, having significance (<0.05).

結(jié)果表明，不同種鐮孢菌對(duì)小麥植株均具有致病力，可引起小麥莖基腐病的典型癥狀，且致病力差異顯著。假禾谷鐮孢菌致病力最強(qiáng)，接種小麥植株發(fā)生死苗，病情指數(shù)為100。禾谷鐮孢菌、輪枝鐮孢菌和層出鐮孢菌病情指數(shù)分別為68.6、44.3和25.7。

將接種發(fā)病的小麥植株經(jīng)表面消毒后，重新在PDA平板上進(jìn)行病菌的分離，均僅分離到了對(duì)應(yīng)的接種病菌，說明分離到的4種鐮孢菌均為小麥莖基腐病的致病菌。

3 討 論

本試驗(yàn)自山東省濟(jì)南、德州、聊城、菏澤、泰安、濰坊、煙臺(tái)、臨沂等8個(gè)地區(qū)采集小麥莖基腐病樣本200余份，分離得到224個(gè)鐮孢菌菌株，經(jīng)鑒定包括、、和，其中假禾谷鐮孢菌占74.74%，為優(yōu)勢(shì)病原菌，該鑒定結(jié)果與澳大利亞、美國(guó)、及中國(guó)大部分地區(qū)小麥莖基腐病病原的鑒定結(jié)果基本一致[5,6,8,10]，但與李偉、張向向等人的鑒定結(jié)果存在差異，他們?cè)趯?duì)安徽、江蘇、河南、湖北、四川、河北等地小麥莖基腐病的病原鑒定中，認(rèn)為小麥莖基腐病的主要病原菌是禾谷鐮孢菌[2,3]。這種差異可能與采集地區(qū)及田間氣候有關(guān)，周海峰對(duì)黃淮麥區(qū)小麥莖基腐病病原的鑒定結(jié)果表明，河南北部以假禾谷鐮孢菌為主，中東部則是禾谷鐮孢菌和假禾谷鐮孢菌混合發(fā)生區(qū)，江蘇及安徽北部以禾谷鐮孢菌分離頻率最高[4]。

不同鐮孢菌對(duì)小麥植株的致病性測(cè)定結(jié)果表明，、、和對(duì)小麥植株均具有致病力，且致病力差異顯著，測(cè)定結(jié)果與吳斌等人的測(cè)定結(jié)果基本一致[5]。假禾谷鐮孢菌致病力最高，病情指數(shù)為100，對(duì)小麥植株的高致病力可能是其成為山東地區(qū)小麥莖基腐病優(yōu)勢(shì)致病菌的一個(gè)重要原因。

本試驗(yàn)明確了山東省小麥莖基腐病的主要致病菌是以假禾谷鐮孢菌為主的鐮孢菌屬真菌，為山東省小麥莖基腐病的綜合防治奠定了病原學(xué)基礎(chǔ)，具有一定的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

（1）山東省小麥莖基腐病的病原鑒定。山東省小麥莖基腐病病原菌包括假禾谷鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、輪枝鐮孢菌和層出鐮孢菌。假禾谷鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)病原菌；

（2）不同病原菌的致病性測(cè)定。不同病原菌對(duì)小麥植株均具有致病性，且致病力差異顯著。假禾谷鐮孢菌致病力最高。

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Pathogen Identification for Wheat Crown Rot in Shandong Province

MENG Cheng-cheng, SUN Xiao-feng*, ZHANG Li, YAN Pei-yao, YU Jin-feng**

College of plant protection/Shandong Agricultural University, Tai’an271018, China

In order to clarify the pathogens composition and dominant species of wheat crown rot in Shandong wheat growing regions, A total of more than 200 samples of wheat stem rot from Jinan, Taian, Dezhou, Weifang, Yantai, Liaocheng, Heze and Linyi was colected, isolated 224 strains, and selected 190 representative strains to analyze their EF-1α sequences and identify the group to which it belongs and determine the pathogenicity of different pathogens. The results showed that among the 190 strains, there are 142 of, 35 of, 6 ofand 7 of.accounts for 74.7% of the identified strains, it is the dominant pathogen of wheat crown rot in Shandong Province.The results of pathogenicity showed that different strains ofspp. had pathogenicity to wheat plants, buthad the strongest pathogenicity.

Wheat crown rot; pathogenic bacteria;; pathogenicity

S435.121

A

1000-2324(2019)05-0753-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.05.004

2019-03-01

2019-04-26

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2017YFD0201705);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資金(SDAIT-01-09)

孟程程(1993-),男,在讀碩士,專業(yè)方向:植物病理學(xué). E-mail:198227006@qq.com

*同等貢獻(xiàn):孫曉鳳(1994-),女,在讀碩士,專業(yè)方向:植物病理學(xué). E-mail:2536606095@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jfyu@sdau.edu.cn