梁延坡， 吳青君， 劉長(zhǎng)仲， 張友軍， 王少麗， 徐寶云

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

谷氨酸是脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在脊椎動(dòng)物體內(nèi)主要通過門控陽離子通道介導(dǎo)興奮性的神經(jīng)傳遞，而在無脊椎動(dòng)物體內(nèi)谷氨酸既是興奮性的神經(jīng)遞質(zhì)［1－3］又是抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)［4］。作為抑制性的神經(jīng)傳遞介質(zhì)，谷氨酸與突觸后受體結(jié)合后，開啟氯離子通道，稱為谷氨酸門控的氯離子通道（glutamate－gated chloride channel，GluCl）［5］。GluCl屬于半胱氨酸環(huán)門控離子通道基因超家族，目前僅在無脊椎動(dòng)物的神經(jīng)和肌肉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［4］，在脊椎動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)，因此是較為理想的殺蟲劑作用靶標(biāo)。作用于GluCl的殺蟲劑包括阿維菌素／美倍霉素類、苯基吡唑類殺蟲劑氟蟲腈以及吲哚二萜類化合物nodulisporic acid等［6－8］。人們對(duì)于GluCl受體的分子結(jié)構(gòu)和功能的了解大多數(shù)來自于對(duì)線蟲和模式昆蟲的研究［5］，而對(duì)農(nóng)業(yè)昆蟲的研究較少。

小菜蛾［Plutellaxylostella（L.）］屬鱗翅目菜蛾科，是世界性的十字花科蔬菜重要害蟲，對(duì)多種殺蟲劑都產(chǎn)生了抗藥性［9］。近年來對(duì)特效生物制劑阿維菌素類也產(chǎn)生了不同程度抗性［10］。早期的研究認(rèn)為，阿維菌素作用于γ－氨基丁酸（GABA）受體達(dá)到殺蟲效果［11］。但是后來的研究發(fā)現(xiàn)，在較低濃度時(shí)，阿維菌素可引起與GABA系統(tǒng)無關(guān)的Cl－通道的開放，即谷氨酸控制的Cl－的開放，從而導(dǎo)致膜對(duì)Cl－通透性增加，帶負(fù)電荷的Cl－引起神經(jīng)元休止電位的超極化，使正常的動(dòng)作電位不能釋放，神經(jīng)傳導(dǎo)受阻，最終引起蟲體麻痹死亡［12］。而且研究發(fā)現(xiàn)，線蟲對(duì)伊維菌素（阿維菌素的衍生物）的主要抗性機(jī)理是GluCl受體α亞基（GluClα）的堿基突變導(dǎo)致與藥物的親和力下降［13］?？梢奊luCl受體是阿維菌素類殺蟲劑的更為主要的作用靶標(biāo)。目前小菜蛾對(duì)阿維菌素的抗性機(jī)理尚未明確，小菜蛾GluCl受體國(guó)內(nèi)外也未見研究報(bào)道。本研究利用反轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）的方法首先對(duì)小菜蛾的GluCl受體α亞基cDNA片斷進(jìn)行克隆和序列分析，然后采用RACE技術(shù)獲取小菜蛾GluCl受體α亞基的全長(zhǎng)序列，為深入研究小菜蛾GluCl受體的分子特性和揭示阿維菌素類殺蟲劑的抗性機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試小菜蛾為于室內(nèi)用甘藍(lán)苗連續(xù)飼養(yǎng)多年的敏感種群，室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為（25±2）℃，RH為50%～70%，光周期L∥D＝16h∥8h。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol Reagent RNA kit和cDNA synthesis kit（SuperScript III）購(gòu) 自 Invitrogen （USA）公 司；dNTP Mix、DNA Marker，100bp DNA Ladder均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自Promega公司；克隆載體pEASY－T1vector、Mach1－T1感受態(tài)細(xì)胞：購(gòu)自全式金公司；PCR產(chǎn)物回收與純化試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司；TaKaRa LA Taq?：TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司，TaKaRa 3′－Full RACE coreset試劑盒：購(gòu)自 TaKa－Ra公司；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit：Clontech公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生工合成；測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成；PCR擴(kuò)增儀為PTC－200，MJR。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總 RNA的提取

參照Trizol Reagent RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總RNA抽提。

1.3.2 cDNA第1鏈合成

按Invitrogen公司的cDNA kit說明書進(jìn)行。cDNA合成步驟參照Invitrogen in SuperScript III First－strand synthesis systeMfor RT－PCR 使 用 程序進(jìn)行。

1.3.3 GluCl受體α基因cDNA片段的克隆

根據(jù)GenBank中已收錄的果蠅（Drosophila melanogaster）和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）GluCl受體α亞基氨基酸序列的保守性區(qū)域，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性上下游引物（表1），進(jìn)行同源克隆。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μL反應(yīng)體系中含：第1鏈cDNA產(chǎn)物2μL，5μL 10×TaqDNA Buffer，2mmol／L dNTP，2mmol／L MgCl2，2μL dNTP（10mmol／L），2μL（10μmol／L）DEGF／DEG－R和0.5μL（5U／μL）TaqDNA polymerase。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)35次，72℃延伸10min。

1.3.4 GluCl受體α亞基全長(zhǎng)基因的克隆

1.3.4.1 GluCl受體α亞基3′－末端cDNA的克隆

根據(jù) TaKaRa 3′－Full RACE coreset Kit說明書合成3′端cDNA，并根據(jù)片段測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)了3條特異性上游引物（表1），用于小菜蛾GluClα3′端cDNA序列的擴(kuò)增，以3′GSP1和3′RACE Outer Primer為第1輪擴(kuò)增引物，以3′GSP2或3′GSP3和3′RACE Inner Primer為第2輪擴(kuò)增引物。

第1輪PCR在50μL反應(yīng)體系中3′cDNA 4μL，1×cDNA Dilution BufferⅡ （Mg2＋Plus）6μL，3′GSP1（10μmol／L）2μL，3′Outer Primer（20μmol／L）2 μL，TaKaRa LATaq（5U／μL）0.25μL，10×LA PCR BufferⅡ（Mg2＋Plus）4μL，去離子水31.75μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min，94℃30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作Nest－PCR 模 板，以 （3′NGSP2／3′RACE Innerprimer）和（3′NGSP3／3′RACE Inner－primer）為引物，進(jìn)行第2輪PCR，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min；94℃30s，58 ℃ 30s，72 ℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.3.4.2 GluCl受體α亞基5′－末端cDNA的克隆

參照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）使用說明進(jìn)行5′cDNA的合成，根據(jù)片段和3′RACE結(jié)果設(shè)計(jì)5′RACE特異性引物（表1）用于獲取5′端cDNA序列。

以5′GSP1和UPM為第1輪引物，94℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，70℃ 30s，72 ℃3min，5 個(gè) 循 環(huán)；94 ℃ 30s，68 ℃ 30s，72 ℃3min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍用5μL做Nest－PCR模板，以5′NGSP1和NUP為第2輪引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃30s，68℃30s，72℃3min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

表1 試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的引物序列

1.3.5 cDNA 全長(zhǎng)的驗(yàn)證

根據(jù)擴(kuò)增得到的5′和3′端片段的序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA的引物 QC－F／QC－R（表1）以驗(yàn)證基因的完整性。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min，94℃30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 2min，35 個(gè) 循 環(huán)；72 ℃10min。

1.3.6 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

將PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收純化后，克隆于PEASY－T1載體中，挑取陽性克隆經(jīng)酶切和PCR鑒定后，送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.7 在線序列比對(duì)和分析程序

蛋白質(zhì)序列分析采用ExPASy在線ScanProsite程序；蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分析采用http∥：www.expasy.org／tools／pi－tool.html在線工具；序列比對(duì)使用ClustalW程序；序列和數(shù)據(jù)搜索使用NCBI上的Blast在線程序；信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用http：∥www.cbs.dtu.dk／services／SignalP 在線程序進(jìn)行；進(jìn)化分析采用 MEGA4.0軟件［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 小菜蛾GluCl受體α亞基cDNA全長(zhǎng)的克隆及序列分析

通過簡(jiǎn)并性上下游引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1a，擴(kuò)增所得的片段大小約為192bp，與預(yù)期的目的擴(kuò)增片段大小相符。將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，所得cDNA片段總長(zhǎng)度為192bp，與已知昆蟲的GluCl受體α亞基氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，與果蠅和飛蝗（Locustamigratoria）的氨基酸序列相似性為80%，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾GluClα亞基基因的部分序列。根據(jù)已獲得的基因序列，分別設(shè)計(jì)5′－和3′－特異性引物，通過 RACE策略，成功的獲得含有5′－及3′－非編碼區(qū)的序列，其中3′端長(zhǎng)度為1 014bp（圖1b），測(cè)序結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，在這個(gè)片段包含一個(gè)TGA終止子以及多個(gè)TAA，在終止子的下游包含一個(gè)長(zhǎng)603bp的非編碼區(qū)（UTR）。末端具有真核生物mRNA典型特征：一個(gè)含15個(gè)腺嘌呤的poly（A），在前面出現(xiàn)了加尾信號(hào) AATAAA；5′－端序列長(zhǎng)為1 090bp（圖1c），在這個(gè)片段中包含一個(gè)起始密碼子（ATG），在起始密碼子前有197bp的非編碼區(qū)（圖2）。序列分析結(jié)果可以證實(shí)得到了小菜蛾GluClαcDNA的完整序列。

圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖譜

將5′－和3′－端序列拼接，得到了基因的全序列。為了進(jìn)一步驗(yàn)證拼接序列的正確性，通過已獲得的序列設(shè)計(jì)了基因編碼區(qū)的特異性引物以擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA片段。PCR擴(kuò)增獲得了與預(yù)期大小相符的條帶，克隆結(jié)果同拼接序列比較，氨基酸序列并無差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了獲得的基因序列的準(zhǔn)確性和完整性。

2.2 序列分析

GluClα亞基cDNA全長(zhǎng)2 144bp，用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，其開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)為1 344bp，編碼447個(gè)氨基酸殘基，根據(jù)在線軟件SignalP 3.0（http：∥www.cbs.dtu.dk／servi－ces／SignalP／）分析GluClα亞基氨基酸序列信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，其信號(hào)肽最有可能的切割位點(diǎn)在第24位與第25位之間，預(yù)測(cè)出GluClα亞基蛋白信號(hào)肽序列含25個(gè)氨基酸，其序列為：MDVLRPSCALFVLFLLYCAHLTECV（圖2）；蛋白質(zhì)切割信號(hào)肽后經(jīng)過簡(jiǎn)單的加工過程而成為成熟肽；預(yù)測(cè)其蛋白分子量為51348.7u，其蛋白序列的理論等電點(diǎn)為8.46；相似性分析表明：它與埃及伊蚊的相似性為75%，與果蠅的相似性為73%，與赤擬谷盜的相似性為73%，與東亞飛蝗的相似性為79%。用在線軟件TMHMM2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)其包含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，TM1－4（圖2）具有 GluClα亞基的典型特征：有一個(gè)長(zhǎng)的N－末端半胱氨酸的胞外區(qū)和4個(gè)跨膜區(qū)和C－端胞外區(qū)，在其親水的胞外區(qū)由2對(duì)十分保守的半胱氨酸二硫鍵形成氨基酸殘基的橋環(huán)，其中第1對(duì)包含13個(gè)氨基酸殘基，第2個(gè)包含10個(gè)氨基酸殘基（圖2），這些特征表明該基因編碼受體α亞基。

圖2 編碼小菜蛾的GluClα亞基核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 進(jìn)化分析

在GenBank中搜索果蠅、赤擬谷盜（TriboliuMcastaneum）、蝗蟲、蜜蜂（Apismellifera）和秀麗隱桿線蟲、犬心絲線蟲（Cylicocyclusnassatus）、腫孔古柏線蟲（Cooperiaoncophora）等物種的GluCl基因的α、β亞基的氨基酸序列，應(yīng)用MEGA4.0軟件通過鄰位法（neighbor－joining）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以1 000次回抽的置信度作置信分析，結(jié)果如圖3所示，分別標(biāo)注在分支節(jié)點(diǎn)上，每個(gè)分支末端依次為不同物種的GluCl的蛋白基因登錄號(hào)和物種名。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：GluCl基因分為Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)組，分別代表GluClα基因和GluClβ基因，Ⅰ組又可分兩亞族：昆蟲組Ⅰa和線蟲組Ⅰb；小菜蛾的GluCl屬于Ⅰa，昆蟲α亞基；由此證明了克隆的基因?yàn)镚luCl受體的α亞基。

3 討論

谷氨酸是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在無脊椎動(dòng)物中GluCl作為抑制性配體起作用，在昆蟲和甲殼類動(dòng)物中，谷氨酸被公認(rèn)為是作用于H受體而導(dǎo)致其去極化的這一假說。目前，在一些線蟲和果蠅屬中，GluCl已被克隆，并在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)，通過已克隆的通道顯示，無脊椎動(dòng)物的GluCl受體上具有阿維菌素類藥劑的作用位點(diǎn)［15］。相對(duì)于線蟲，人們對(duì)昆蟲GluCl受體研究較少，其通道特性與線蟲的亦有所不同。目前GluCl受體在其他昆蟲如非洲鈍緣蜱、扁虱、草地貪夜蛾、谷實(shí)夜蛾［16］、美洲大蠊［7］、家蠅［17］和東亞飛蝗［18］等體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)，但目前對(duì)任何生物的GluCl亞基的構(gòu)成都不明確。

圖3 不同物種間GluCl蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

靶標(biāo)不敏感性是害蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性極為重要的一種機(jī)制，尤其與高水平抗性有關(guān)。遺傳學(xué)研究表明，小菜蛾對(duì)阿維菌素的抗性是常染色體、不完全隱性遺傳，而且可能是有多基因控制的抗性遺傳［19］。吳青君［20］的研究認(rèn)為，GABA 受 體 結(jié)合 數(shù)目的降低是小菜蛾對(duì)阿維菌素產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制之一，放射性配體結(jié)合分析表明，敏感和抗性種群的受體親和力均無顯著差異，但抗性種群受體最大的結(jié)合數(shù)目比敏感種群降低了63.6%，說明是受體數(shù)目的減少，而不是結(jié)構(gòu)上的改變導(dǎo)致了小菜蛾對(duì)阿維菌素的抗性。目前，還沒有GluCl受體不敏感性與昆蟲抗藥性關(guān)系的報(bào)道。本研究首次利用簡(jiǎn)并引物通過RT－PCR和RACE技術(shù)成功地克隆了小菜蛾GluClα亞基的全長(zhǎng)序列，根據(jù)這段序列可設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行抗性小菜蛾cDNA全長(zhǎng)克隆和功能表達(dá)，比較其抗性和敏感種群的氨基酸差異，從分子水平明確小菜蛾GluCl功能亞基的分子性質(zhì)，為研究小菜蛾對(duì)阿維菌素類殺蟲劑抗性靶標(biāo)不敏感的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

［1］Gration K A，Clark R B，Usherwood P N.Three types of L－glutamate receptor on junctional membrane of locust muscle fibres［J］.Brain Research，1979，171（2）：360－364.

［2］Patlak J B，Gration K A，Usherwood P N.Single glutamateactivated channels in locust muscle［J］.Nature，1979，278：643－645.

［3］Uitsch A，Schuster C M，Laube B，et al.Glutamate receptors ofDrosophilamelanogaster：cloning of a kainite－selective subunit expressed in the central nervous system［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89（21）：10484－10488.

［4］Cleland T A.Inhibitory glutamate receptor channels［J］.Mol Neurobiol，1996，13：97－136.

［5］吳青君，張友軍，徐寶云.抑制性谷氨酸受體（IGluRs）通道及其相關(guān)殺蟲劑的作用［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10（3）：251－259.

［6］Bloomquist J R.Chloride channels as tools for developing selective insecticides［J］.Arch Insect BiocheMPhysiol，2003，54：145－156.

［7］Zhao X L，Yeh J Z，Salgado V L，et al.Fipronil is a potent open channel blocker of glutamate－activated chloride channels in cockroach neurons［J］.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2004，314（1）：363－373.

［8］Smith MM，Warren V A，Thomas B S，et al.Nodulisporic acid opens insect glutamate－gated chloride channels：identification of a new high affinity modulator［J］.Biochemistry，2000，39（18）：5543－5554.

［9］吳青君，張文吉，朱國(guó)仁.小菜蛾的發(fā)生為害特點(diǎn)及抗藥性現(xiàn)狀［J］.中國(guó)蔬菜，2001（5）：49－51.

［10］Syed T S，Abro G H，Ahmed S.Efficacy of different insecticides againstPlutellaxylostellaunder field conditions［J］.Pakistan Journal of Biological Sciences，2004，7（1）：10－13.

［11］Campbell W C.Ivermectin：an update［J］.Parasitol Today，1985，1（1）：10－16.

［12］Shoop W L，Mrozik H，F(xiàn)isher MH.Structure and actvity of avermectins and milbemycins in animal health［J］.Veterinry Parasitology，1995，59（2）：139－156.

［13］Kane N S，Hirschberg B，Qian S，et al.Drug－resistantDrosophilaindicate glutamate－gated chloride channels are targets for the antiparasitics nodulisporic acid and ivermectin ［J］.PNAS，2000，97（25）：13949－13954.

［14］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Mol Biol Evol，2007，24：1596－15991.

［15］Cully D F，Wilkinson H，Vassilatis D K，et al.Molecular biology and electrophysiology of glutamate－gated chloride channels of invertebrates［J］.Parasitology，1996，113：S191－S200.

［16］Cully D F，Paress P F，Liu K K，et al.Identification of aDrosophilamelanogasterglutamate－gated channel sensitive to the antiparasitic agent avermectin［J］.The American Society for Biochemistry and Molecular Biology，1996，271：20187－20191.

［17］Eguchi Y，Ihata M，Ochi E，et al.Functional characterization ofMuscaglutamate－and GABA－gated chloride channels expressed independently and coexpressed inXenopusoocytes［J］.Insect Molecular Biology，2006，15（6）：773－783.

［18］Janssen D，Derst C，Buckinx R，et al.Dorsal unpaired median neurons ofLocustamigratoriaexpress ivermectin and fipronilsensitive glutamate－gated chloride channels［J］.Journal of Neurophysiology，2007，97：2642－2650.

［19］李騰武，高希武，鄭炳宗，等.小菜蛾對(duì)阿維菌素的抗性遺傳分析及交互抗性研究［J］.植物保護(hù)，1999，25（6）：12－14.

［20］吳青君，張文吉，張友軍，等.表皮穿透和GABAA受體不敏感性在小菜蛾對(duì)阿維菌素抗性中的作用［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2002，45（3）：336－340.