儀美芹, 姜興印, 李學(xué)鋒, 李召虎*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 100193;3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,泰安 271018)

Thielert 2006年研究發(fā)現(xiàn)棉花使用吡蟲啉拌種后不僅防治了苗期蚜蟲,且植株長勢表現(xiàn)出葉色濃綠,株高、根長與清水對(duì)照比都有增加[1],說明農(nóng)藥除了對(duì)危害農(nóng)作物的病蟲草害有控制效果之外,還對(duì)作物本身存在其他的影響。很多研究報(bào)道了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)作物光合作用、主要營養(yǎng)物質(zhì)、次生物質(zhì)及次生代謝、活性氧代謝、體內(nèi)酶的變化、根系活力及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等主要生理生化指標(biāo)都存在一定的影響[2]?；瘜W(xué)農(nóng)藥高劑量使用后會(huì)對(duì)作物造成藥害,輕者減產(chǎn),重者可使作物死亡。但是農(nóng)藥在常量使用下,表面上對(duì)作物沒有造成藥害,作物外表沒有明顯的變化,但是其生理生化指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生一些變化,其中除草劑對(duì)作物的生理生化影響研究較多[3-6]。通常有關(guān)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)作物的負(fù)面影響研究很多[7-8],而農(nóng)藥對(duì)作物有一定的刺激生長效果研究很少。植物根系是活躍的吸收器官和合成器官,根系活力是衡量根系功能的主要指標(biāo)之一,根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內(nèi)的保護(hù)酶系,SOD與CAT的活性上升,則說明植物的抗逆性有了增強(qiáng),這方面已有多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道[9]。

本試驗(yàn)以70%吡蟲啉水分散粒劑為試驗(yàn)藥劑,番茄作為研究作物,研究了吡蟲啉對(duì)番茄幼苗生長的影響,如植株長勢、主根長、葉片展開的數(shù)量、番茄葉片和根系的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性和根系活力等指標(biāo),探討吡蟲啉使用后對(duì)番茄體內(nèi)生理生化指標(biāo)與地上部的生長量的關(guān)系,以尋求吡蟲啉使用后對(duì)植物本身的影響。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試藥劑：70%吡蟲啉水分散粒劑(拜耳作物科學(xué)公司提供);

供試作物為番茄(麥好特,遼寧錦州鑫園世家種業(yè)有限公司)。

供試試劑：T riton X-100,美國進(jìn)口,上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝經(jīng)銷;聚乙烯吡咯烷酮(PVPP);1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB),Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)主要儀器：紫外分光光度計(jì),生化光照培養(yǎng)箱,高速冷凍離心機(jī),勻漿器等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和施藥方法

本試驗(yàn)采用盆栽法(花盆大小為：180 mm×210 mm,盆缽中裝入的土量均為2.4 kg),于番茄幼苗移栽返苗后兩葉一心期,即有2片葉片明顯展開,心葉明顯可見時(shí)處理,試驗(yàn)藥劑按有效成分用量設(shè)計(jì)5個(gè)濃度：1.0、1.5、2.5、3.0、5.0 mg/株,每個(gè)處理濃度4次重復(fù),每個(gè)重復(fù)5盆,共20盆。將試驗(yàn)藥劑按照設(shè)計(jì)劑量均勻澆灌到盆缽中,每盆用水量均為100 mL。藥劑處理3 d后開始觀察番茄長勢,30 d測定番茄的生長量,如株高、根長、地上部的鮮重等;同時(shí)測定番茄葉片和根系中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及番茄的根系活力。

1.3 過氧化氫酶活性測定

過氧化氫酶(CAT)粗酶液的提取;分別取吡蟲啉處理后30 d的番茄地上部(由下往上第5、6和7片展開葉)和地下根系部分各15 g,各自混合后,均分3份,加入預(yù)冷0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液(含0.1%聚乙烯吡咯烷酮)適量和少許石英砂,用電動(dòng)勻漿器冰浴充分研磨后定容至20.0 mL,取2.0 mL勻漿液再加6 mL緩沖液,4℃下以5 000 g離心力離心10 min,取上清液為粗酶液。

過氧化氫酶(CAT)活性測定：在4 mL反應(yīng)系統(tǒng)中含有0.1 mol/L(pH7.0)磷酸緩沖液2.0 mL、0.1%的H2O21.0 mL和1.0 mL用緩沖液稀釋30倍的粗酶液。25℃預(yù)熱后,加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng),迅速測定4 min內(nèi)A240值的變化。以每分鐘每克樣品A240改變0.01為一個(gè)酶活單位,新鮮材料中酶的比活以U?min-1?g-1表示。

1.4 超氧化物歧化酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定,分別取吡蟲啉處理后30 d的番茄地上部(由下往上第5、6和7片展開葉)和地下根系部分各20 g,各自混合后,均分3份,加入適量預(yù)冷的50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液,該緩沖液含有0.1 mmol/L EDTA;質(zhì)量濃度0.3%T ritonX-100;質(zhì)量濃度4%聚乙烯吡咯烷酮。用電動(dòng)勻漿器冰浴充分研磨后定容至20.0 mL,取2.0 mL勻漿液再加6 mL緩沖液,4℃下以10 500 g離心力離心20 min,取上清液為粗酶液。

采用氯化硝基氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定SOD活性。在3 mL反應(yīng)混合液(在27 mL 14.5 mmol/L DL-甲硫氨酸中分別加入均以50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液配制的3 μ mol/L EDTA,2.25 m mol/L NBT和60 μ mol/L核黃素各2 mL)的試管中,加入1 mL粗酶液,混合后放在透明的試管架上,在25℃4 000 lx光照培養(yǎng)箱內(nèi)光照10 min,取出試管,迅速測定A560值,以不加酶液的照光管為對(duì)照。酶活性單位采用抑制NBT光化還原50%的酶量為一個(gè)酶活性單位,新鮮材料中酶的比活力以U?mg-1?g-1表示。

1.5 根系活力的測定

番茄根系活力測定采用TTC法[10]。具體方法如下：氯化三苯基四氮唑(TTC)是一種氧化——還原色素,溶于水為無色溶液,但可被根系細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶等還原,生成紅色的不溶于水的TTF。因此,TTC還原強(qiáng)度可以在一定程度上反映根系活力。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取 T TC(0.4%)2 mL置于100 mL容量瓶中,加少許硫代硫酸鈉,生成紅色T TF后,用95%乙醇定容至 100 mL,搖勻;取上述溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5 、3.0 mL 于試管(≥15 mL)中,然后對(duì)應(yīng)加入 10、9.5、9、8.5、8、7.5、7 mL 95%乙醇;得到 T TF 0 、50、100、150、200、250、300 μ g;在 484 nm 處比色 。

根活力測定：稱取番茄(吡蟲啉處理后30 d)的根系0.2～0.5 g置于小的培養(yǎng)皿中,利于封口,避免T TC被氧化,各自混合后,均分 3份,加入0.4%T TC和磷酸緩沖液各10 mL,于37℃下避光保溫反應(yīng)5～10 h,取出后加入10 mL 1 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng);同時(shí),以10 mL 1 mol/L硫酸溶液代替磷酸緩沖液先加入,后加0.4%T TC作為CK;取出根系,吸水紙吸干,置于≥15 mL試管中,加入10 mL 95%乙醇,封口,置于暗處,浸提 12 h,倒出在484 nm處比色。

結(jié)果計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉處理番茄幼苗后30 d對(duì)番茄生長的影響

由表1結(jié)果看出,吡蟲啉1、1.5、2.5 mg/株的劑量處理番茄幼苗后30 d植株展開葉片數(shù)、株高、根長、地上部鮮重、地下部鮮重等指標(biāo)隨劑量增大明顯增加,且都明顯高于清水對(duì)照,但是3.0 mg/株的劑量處理的番茄生長指標(biāo)雖然高于清水對(duì)照但低于2.5 mg/株的處理;而5.0 mg/株的劑量處理后的番茄的各項(xiàng)生長指標(biāo)低于清水對(duì)照的各項(xiàng)指標(biāo),說明5.0 mg/株的劑量處理番茄,植株生長已全面受到抑制。

表1 吡蟲啉處理番茄幼苗后30 d對(duì)番茄生長的影響1)

2.2 吡蟲啉處理番茄幼苗后30 d對(duì)番茄CAT活性的影響

由圖 1 可以看出,吡蟲啉 1.0、1.5、2.5、3.0、5.0 mg/株處理番茄幼苗后均在一定程度上提高了番茄植株葉片、根系CAT的活性,且隨藥劑劑量的增大CAT活性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

圖1 吡蟲啉不同處理對(duì)番茄幼苗CAT活性的影響

2.3 吡蟲啉處理番茄幼苗后30 d對(duì)番茄SOD活性的影響

吡蟲啉1.5、2.5 mg/株的劑量均提高了番茄植株葉片、根系中SOD的活性,尤其是以2.5 mg/株的劑量提高的幅度較大,而3.0、5.0 mg/株的劑量雖與對(duì)照相比葉片、根系SOD活性有提高,但低于2.5 mg/株劑量的葉片SOD的活性,隨藥劑劑量的增大表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖2)。

圖2 吡蟲啉不同處理對(duì)番茄幼苗SOD活性的影響

2.4 吡蟲啉處理番茄幼苗后30 d對(duì)番茄根系活力的影響

由圖3結(jié)果看出,吡蟲啉1.0、1.5、2.5、3.0 mg/株和5.0 mg/株處理番茄后30 d均在一定程度上提高了番茄根系活力,尤其是2.5 mg/株的劑量提高的幅度較大,作用顯著。5.0 mg/株處理比3.0 mg/株處理番茄根系活力下降,說明番茄根系活力并不是隨著濃度越高對(duì)番茄根系活力提高越大,而是隨藥劑劑量的增大表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

圖3 吡蟲啉不同處理對(duì)番茄幼苗根系活力的影響

3 討論

通過試驗(yàn)結(jié)果可看出,隨著吡蟲啉處理劑量的增加,藥后30 d番茄植株展開葉片數(shù)、株高、根長、地上部分鮮重、地下部分鮮重會(huì)有一定程度提高,其中2.5 mg/株的劑量對(duì)番茄的各項(xiàng)指標(biāo)提高程度達(dá)最大值,隨后開始下降。

通過測定不同劑量的吡蟲啉對(duì)番茄葉片及根系中CAT、SOD的活性的影響,結(jié)果表明吡蟲啉1.5、2.5、3.0 mg/株均促進(jìn)了植株葉片、根系 CAT、SOD的活性,尤其是以2.5 mg/株的增加效果最顯著。說明吡蟲啉對(duì)番茄生理生化指標(biāo)的影響并不是隨著藥劑濃度的增加,測定的各種酶活性增強(qiáng),而是有一個(gè)最佳劑量,超過這個(gè)劑量反而有下降的趨勢。

通過測定不同劑量的吡蟲啉對(duì)根系活力的影響,1.0、1.5、2.5 mg/株處理均在一定程度上提高了番茄的根系活力,尤其是2.5 mg/株提高的幅度較大,作用顯著。3.0 mg/株和 5.0 mg/株兩個(gè)處理,根系活力雖然比對(duì)照根系活力有所提高,但比2.5 mg/株處理根系活力降低,這與不同劑量的吡蟲啉對(duì)番茄其他指標(biāo)的影響一致。

吡蟲啉使用后增加了番茄葉片和根系的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性,這些具有保護(hù)性的酶,提高了植物體內(nèi)對(duì)外界的抵抗力,使作物長的健康早熟,因此使用不同濃度的吡蟲啉處理的番茄苗從根長和展開葉片數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過清水對(duì)照。

根系活力是指根的吸收和合成代謝能力等,生長速度是根活力的整體表現(xiàn)[11]。不同濃度的吡蟲啉對(duì)番茄的根活力影響,以劑量2.5 mg/株對(duì)根系活力影響最大。

以上結(jié)果表明不同劑量的吡蟲啉對(duì)番茄葉片和根系的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及根系活力的影響趨勢,與吡蟲啉使用后植物生長表現(xiàn)趨勢有一定的相關(guān)性。推測吡蟲啉處理番茄引起了番茄體內(nèi)保護(hù)性酶系以及根系活力的提高,從而導(dǎo)致番茄生長指標(biāo)的變化。植物體生理生化指標(biāo)之間的變化是相輔相成的,導(dǎo)致一種指標(biāo)發(fā)生變化,相應(yīng)的其他指標(biāo)都有發(fā)生變化的可能,實(shí)際上植物體內(nèi)生理生化指標(biāo)還有許多,尚待進(jìn)一步研究,以更加全面地認(rèn)識(shí)吡蟲啉對(duì)番茄的刺激生長的機(jī)理。

[1]Thielert W.A unique product：The sto ry of the imidacloprid stress shield[J].Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer,2006,59(1)：73-84.

[2]劉井蘭,于建飛,印建莉,等.化學(xué)農(nóng)藥對(duì)植物生理生化影響的研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥,2006,45(8)：511-514.

[3]李貴,吳競侖.除草劑對(duì)作物生理生化指標(biāo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(29)：9157-9159.

[4]王華,薛懷清,郭曉東,等.10.8%高效氟吡甲禾靈乳油對(duì)林木生理生化影響的研究[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,2005,26(11)：19-22.

[5]黃春艷 ,陳鐵保 ,王宇,等.3種除草劑對(duì)玉米苗生長影響的研究[J].植物保護(hù),2000,26(1)：17-19.

[6]張育平,婁國強(qiáng),李廣領(lǐng),等.吡氟氯禾靈對(duì)核桃幼苗生長量及生理效應(yīng)的影響[J].農(nóng)藥 ,2006,45(2)：131-132.

[7]羅時(shí)石,王澤港,馮緒猛,等.農(nóng)藥對(duì)水稻葉片光合產(chǎn)物輸出速率影響的示蹤動(dòng)力學(xué)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(9)：1085-1089.

[8]吳進(jìn)才,許俊峰,馮緒猛,等.稻田常用農(nóng)藥對(duì)水稻3個(gè)品種生理生化的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(5)：536-541.

[9]陳輝蓉,吳振斌,賀鋒,等.植物抗逆性研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2001,2(3)：7-13.

[10]鄒琦.植物生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2000：62-63,134-137.

[11]康朵蘭,王惠群,蕭浪濤,等.馬鈴薯主要生理性狀和產(chǎn)量性狀相關(guān)性的研究[J].中國馬鈴薯,2007,21(3)：149-152.