安利華，周小敏，方旭波，陳小娥

（1.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江舟山 316101；2.浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山 316000）

國內外用于制作魚糜的原料品種有幾十種，一般選用白色肉魚類，如狹鱈、海鰻等優(yōu)質魚類作原料，生產(chǎn)的魚糜制品彈性和色澤較好。但是，隨著近年來傳統(tǒng)加工魚糜的魚種資源的衰退，在實際生產(chǎn)中，國內眾多生產(chǎn)廠家從經(jīng)濟角度考慮，選用資源豐富、價格低廉、不受季節(jié)限制的冷凍小規(guī)格白姑魚、帶魚、紅娘魚等低值魚作為替代品以解決傳統(tǒng)優(yōu)質魚糜加工原料嚴重枯竭的難題。但是，這類低值魚的凝膠特性較差，在凍藏過程中容易發(fā)生冷凍變性，從而進一步導致其凝膠性能下降，研究其魚肉蛋白在凍藏中的物理化學變化及防止冷凍變性是魚糜加工業(yè)面臨的重要課題。為此，本研究以舟山產(chǎn)的冷凍小規(guī)格白姑魚Argyrosomus argentatus為研究對象，通過研究魚肉蛋白在不同溫度下凍藏時生化特性和功能特性的變化來探討其凍藏穩(wěn)定性，揭示其蛋白冷凍變性的規(guī)律，為防止白姑魚魚肉蛋白冷凍變性方面的研究提供參考。

目前工業(yè)中，最常用的抗冷凍劑是蔗糖和山梨醇，通過抗冷凍劑的添加，能有效地防止魚肉蛋白質的冷凍變性，但由于甜度和熱量高，不符合“低甜、低熱”的消費趨勢。因而，開發(fā)低甜度、低熱量抗凍劑成為近來魚糜加工業(yè)的重要課題，乳糖醇、聚葡萄糖、麥芽糊精及高度分支和線型寡聚糖的抗凍效果已得到較為廣泛的研究[1]。海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，在食品和藥品中，它可以非常有效地保護生物膜和生物大分子，避免細胞受到干燥、冷凍和滲透壓巨變造成的傷害，可用于食品保鮮、食品甜味劑，甜味弱(只有蔗糖的45%)、熱值低(只為蔗糖的1/4)，而且化學性質穩(wěn)定。乳酸鈉是一種安全、高效、無甜味、低熱值的防腐保鮮劑及水分保持劑。筆者研究了海藻糖、乳酸鈉對冷凍小規(guī)格白姑魚魚糜蛋白的抗凍效果，取得了比較好的實驗效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

冷凍白姑魚（規(guī)格：30～50 g/尾），由浙江興業(yè)集團有限公司提供。

1.1.2 試劑

三磷酸腺苷二鈉(ATP)、5,5-二硫代雙(二硝基苯甲酸)購于上海生物化工有限公司，1-苯奈氨-8磺酸(ANS)購于Sigma公司，牛血清蛋白購于上海博奧生物科技有限公司，海藻糖(純度98%)購于廣西南寧中諾生物工程有限責任公司，乳酸鈉(濃度75%)購于青島豐泰化工有限公司，液體山梨糖醇(食品級)購于廣州合誠化學有限公司，馬來酸、鉬氨酸、甘油、高氯酸、硼酸、蔗糖等均為國產(chǎn)分析純或生化級試劑。

1.1.3 主要儀器與設備

日立CR21G II高速冷凍離心機、TM-1000臺式掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）、TQ-5型斬拌機（廣東恒聯(lián)食品機械廠）；SD-700魚糜彈性儀（日本RHEOTEX公司）；半微量凱氏蒸餾裝置、索氏脂肪抽提器等。

1.2 方法

1.2.1 白姑魚肌肉及魚糜一般化學成分的測定[2]

水分（直接干燥法測定）、灰分（高溫爐550℃灼燒法測定）、粗蛋白（微量凱氏定氮法測定）、粗脂肪（索氏脂肪抽提法測定）。

1.2.2 鮮度指標的測定

VBN：康微氏皿法；K 值：HPLC 測定[3]；pH：pH 計測定。

1.2.3 魚肌肉各種蛋白成分的分離及測定

稱取5 g魚肉或魚糜，加入50 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.5)，均質2 min，9 000 r/min，4℃離心10 min，沉淀加入50 mL磷酸鹽緩沖液重復以上操作，合并2次上清液，加入15%三氯乙酸溶液使其終濃度為5%，9 000 r/min，4℃離心10 min，得上清液A(非蛋白氮)和沉淀B(肌漿蛋白)。以上操作所得沉淀加入10倍磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.5，含有0.45 mol/L KC1)，均質，9 000 r/min 4℃ 離心15 min，重復上述操作1次，合并上清液(肌原纖維蛋白)和沉淀。在沉淀中加入5倍0.1 mol/L NaOH溶液，4℃攪拌提取12 h，9 000 r/min 4℃離心15 min得上清液D(堿溶性蛋白)和沉淀E(基質蛋白)，以上各組分分離出來后，采用凱式定氮法測定蛋白含量。

1.2.4 肌原纖維蛋白的提取

魚肉中加入5倍(W:V)0.05 mol/L KC1-20 mmol/L Tris-maleate緩沖液(pH 7.0)混勻，9 000 r/min 4℃離心10 min，棄去上清液，重復洗滌1次。沉淀加入3倍(W:V)0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate緩沖液，10 000 r/min勻漿90 s。尼龍濾網(wǎng)過濾結締組織，靜置30 min以充分溶解蛋白，9 000 r/min 4℃離心20 min。收集上清液，使用10倍體積蒸餾水稀釋溶液使肌原纖維蛋白沉淀，棄除上層清液，析出蛋白于9 000 r/min，4℃離心5 min，沉淀由同體積0.6 mol/L KCl溶解。

1.2.5 肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性測定

Ca-ATPase活性的測定提取肌動球蛋白參考文獻[4]的方法，Ca-ATPase活性以每毫克蛋白質在每分鐘內生成的無機磷(Pi)的量μmol(Pi)/（mg·min）表示，采用鉬酸氨法測定反應中釋放的無機磷(Pi)含量[5]。

1.2.6 魚糜及魚糜凝膠的制備

（1）魚糜生產(chǎn)工藝流程

原料魚(冷凍白姑魚)處理→清洗→采肉→淡堿水（0.5%NaHCO3溶液，1：4）漂洗3次→旋轉篩初次脫水→螺旋壓榨脫水→精過濾→成型機成型→平板機速凍→凍藏。

（2）魚糜蛋白凝膠的制備

將凍藏的冷凍魚糜1 000 g，半解凍后用斬拌機在10℃以下空擂5 min，添加質量分數(shù)為3.0%的食鹽繼續(xù)鹽擂30 min，整個過程保證溫度在10℃以下，真空脫氣。將魚糜填充至直徑為30 mm的尼龍腸衣中，兩端結扎，采用兩段加熱法(40℃加熱30 min后90℃加熱30 min)制備魚糜凝膠。加熱后迅速將魚腸置于冰水中冷卻10 min，然后置于4℃過夜后用于凝膠強度的測量。

1.2.7 凝膠強度的測定

將制備好的魚腸取出，在室溫條件下放置3 h，再剝去薄膜后，切成長度25 cm的小段。將小段放在彈力測試機的測試平臺上，用直徑為5 mm的球形測試頭壓入其端面中心，測試頭的推進速度為60 mm/min，試樣破裂時讀取推進的強度和凹陷值。用同樣方法測試5塊，取其平均值。凝膠強度=破斷強度×凹陷程度，單位為 g·cm。

1.2.8 掃描電鏡觀察

魚糜樣品切為5 mm的立方體，浸入包埋劑(OCT)中，分別凍藏于3種溫度條件下。凍藏結束后取出，將魚糜凝膠樣品用質量分數(shù)為2.5%戊二醛溶液4℃下固定24 h，再用濃度0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)漂洗3次。然后用質量分數(shù)為1%的鋨酸溶液固定2 h，再用濃度為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)漂洗3次。依次用不同濃度梯度（包括50%、70%、80%、90%、95%五個濃度）的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，最后用醋酸異戊酯脫乙醇，用二氧化碳臨界點干燥儀進行干燥，真空離子濺射鍍白金膜。將處理好的樣品在TM-1000臺式環(huán)境電子顯微鏡中觀察，加速電壓為20 kV。

1.2.9 不同抗凍劑魚糜樣品的制備

將漂洗樣品分成4份，1份不添加任何抗凍劑，作為對照樣魚糜，另3份分別添加8%海藻糖、8%乳酸鈉及8%商業(yè)抗凍劑，攪拌均勻于-20℃凍藏，定期取樣測定各項指標。

2 結果與討論

2.1 白姑魚肌肉與魚糜的化學成分及鮮度指標

白姑魚肌肉與魚糜的化學成分及鮮度指標見表1。由表1可知，在白姑魚魚肉中，以干重計算，蛋白質含量為81.70%，而且色素蛋白含量低，能夠滿足魚糜的加工要求；其脂肪含量較高9.75%，因此在魚糜加工中應考慮脫脂。原料魚K值為11.34%，而K值低于20%的魚屬于新鮮度比較高的魚，原料的pH為6.37，說明原料處于pH下降階段，是較為新鮮的[6]；但由于魚糜最佳凝膠pH在6.5～7.5之間，所以應采用堿漂洗提高原料的pH，且堿漂洗可部分脫脂。TVBN值為145.7 μg/g，低于200 μg/g，進一步證明了原料的新鮮程度。白姑魚加工成魚糜后，蛋白含量提高8.02%，灰分和脂肪含量分別比魚肉降低了72.91%和57.74%，說明漂洗過程中去除了魚肉中大部分脂肪和鹽類。此外，pH得到一定程度的提高，有利于魚糜凝膠的形成。

2.2 白姑魚魚肉及魚糜蛋白組成

白姑魚魚肉及魚糜蛋白中各種蛋白組分的含量見表2。由表2可知，各組分蛋白含量之間差異明顯，其中含量最高的是肌原纖維蛋白，達到51.3%，其次是堿溶性蛋白、肌漿蛋白、非蛋白氮和基質蛋白。白姑魚的魚肉在加工成魚糜以后，由于經(jīng)過漂洗工序，蛋白組分比率發(fā)生了變化，肌原纖維蛋白的含量相對升高，比魚肉中增加了16.9%。而非蛋白氮和肌漿蛋白含量大大降低，分別降低了52.0%和55.45%，由此可見，漂洗工序很大程度上去除了白姑魚魚肉中的非蛋白氮和水溶性蛋白。一般來說，水溶性蛋白對魚糜凝膠的形成并無貢獻，而且與肌原纖維蛋白一起加熱時，會影響肌原纖維蛋白的充分溶出和形成凝膠網(wǎng)狀結構。小白姑魚中水溶性蛋白比例較低，因此在制備魚糜時有利于提高產(chǎn)率和魚糜制品質量。

2.3 白姑魚肌原纖維蛋白在凍藏過程中Ca-ATPase活性變化

白姑魚魚肉在-10℃、-20℃和-30℃凍藏過程中肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性的變化情況如圖1。從圖1可以看出，隨著凍藏時間的延長，3個溫度下凍藏的魚肉蛋白Ca-ATPase活性均呈下降趨勢。在凍藏開始4周內，所有樣品的Ca-ATPase活性下降都比較明顯。之后-30℃凍藏的魚肉蛋白Ca-ATPase活性下降不明顯，-20℃凍藏的魚肉蛋白在4～6周過程中仍下降比較顯著，6～12周下降程度較小，而-10℃凍藏的魚肉蛋白在凍藏過程中一直有比較顯著的降低，凍藏結束時活性幾乎喪失。在12周后，-30℃、-20℃和-10℃凍藏魚肉的肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性分別從凍藏前的0.391 μmol(Pi)/（mg·min）下降到0.231 μmol(Pi)/（mg·min），0.151 μmol(Pi)/（mg·min）和0.081 μmol(Pi)/（mg·min），依次下降了40.9%、61.4%和79.3%。

ATPase位于肌球蛋白頭部，當肌球蛋白在凍藏過程中發(fā)生變性時，則ATPase活性受到嚴重影響，失去活性，故測定ATPase的活性能較好地反映肌球蛋白的變性情況[7]。魚肉在凍藏過程中，蛋白中氫鍵、疏水鍵、二硫鍵和離子鍵的改變會導致蛋白結構的變化，使蛋白固有的酶活性降低，降低程度與魚種有關。圖1結果表明，小規(guī)格的白姑魚魚肉抗凍性弱，魚肉蛋白在凍藏過程中容易發(fā)生變性，凍藏時間越長，變性程度越大；同時，蛋白的變性程度和凍藏溫度有關，在-30℃、-20℃和-10℃凍藏時，變性程度差異顯著，凍藏溫度越低變性速度越慢。

2.4 白姑魚魚糜在凍藏過程中凝膠特性變化

從不同凍藏溫度下魚糜凝膠強度變化趨勢圖(圖2)中可知，隨著凍藏時間的延長，凝膠強度呈明顯下降趨勢。魚糜在-10℃凍藏時，凝膠強度下降最快，凍藏12周后，凝膠強度由凍藏前的183.1 g·cm降低到107.1 g·cm，下降了41.5%。而魚糜在-20℃和-30℃凍藏條件下凝膠強度下降緩慢，-30℃凍藏12周后，凝膠強度仍達158.2 g·cm，為魚糜原樣的86.4%。

表1 白姑魚魚肉及魚糜的化學成分(g/100 g)及鮮度指標Tab.1 Chemical composition(g/100 g)and freshness index of surimi and fish meat

表2 白姑魚魚肉及魚糜的蛋白質組分(g/100 g)Tab.2 Protein compositions(g/100 g)of Argyrosomus argentatus surimi and fish meat

圖1 白姑魚肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性在凍藏過程中的變化Fig.1 The Ca-ATPase activity changes of Argyrosomus argentatus during frozen-storage

圖2 白姑魚魚糜凝膠強度在凍藏過程中的變化Fig.2 The gel strengthen changes of Argyrosomus argentatus surimi during frozen-storage

2.5 白姑魚魚糜凍藏后微觀結構變化

實驗對-30℃、-20℃和-10℃凍藏14周后的魚糜樣品進行電鏡觀察，照片如圖3所示。從圖3可以看出，魚糜在-10℃凍藏后，魚糜微結構雜亂，組織間空隙明顯，結晶水比例較大，說明冰晶顆粒較大；-20℃凍藏時，魚糜結構顯示出一定的規(guī)律，冰晶顆粒較?。?30℃凍藏后，魚糜結構致密，冰晶排列呈規(guī)律分布，顆粒很小，對蛋白質的立體結構破壞較小。這些結果說明，魚糜在不同溫度凍藏時，魚糜中蛋白質變性的速度和程度不同，在較高溫度下凍藏，蛋白變性速度快，其主要原因是魚糜中有更多的結合水形成冰晶，冰晶顆粒的增長加速了蛋白變性。

2.6 不同抗凍劑對凍藏白姑魚魚糜蛋白凝膠強度的影響

圖3 不同溫度凍藏條件下魚糜微結構觀察Fig.3 The ultra-structures of of Argyrosomus argentatus surimi during frozen-storage at

白姑魚魚肉在凍藏過程中容易發(fā)生冷凍變性，導致魚糜凝膠劣化，因此，開發(fā)優(yōu)質冷凍白姑魚魚糜，必須找到有效的抗凍劑來抑制蛋白的冷凍變性。實驗對海藻糖、乳酸鈉對白姑魚魚糜蛋白的抗凍效果進行了研究，并與傳統(tǒng)的“商業(yè)抗凍劑”（蔗糖/山梨糖醇）進行比較，結果見圖4。

圖4表明，對照樣白姑魚魚糜的凝膠強度隨著凍藏時間的增加明顯下降，其中，第1周下降最顯著，約下降了9.0%；添加抗凍劑后，凝膠強度下降趨勢要緩慢得多。凍藏12周后，對照樣凝膠強度只有139.2 g·cm，下降了24.0%；而添加海藻糖、乳酸鈉和蔗糖/山梨糖醇后，凝膠強度分別為 163.1 g·cm、156.4 g·cm 和161.5 g·cm，海藻糖和乳酸鈉樣品差別不明顯，與商業(yè)抗凍劑樣品相當，凝膠強度的下降程度依次為10.9%、14.6%和11.8%，均顯著低于對照樣。以上結果說明，白姑魚魚糜蛋白在凍藏過程中易發(fā)生變性，凝膠能力下降，而3種抗凍劑具有較好的抗凍效果，可顯著抑制其凝膠能力的降低。其中海藻糖和乳酸鈉的抗凍效果與商業(yè)抗凍劑相當。

2.7 不同抗凍劑對凍藏白姑魚魚糜蛋白Ca-ATPase活性的影晌

由圖5可知，隨著凍藏時間增加，對照樣Ca-ATPase活性不斷下降，凍藏12周后，其活性只有0.151 μmol(Pi)/（mg·min），下降61.3%；而添加3種抗凍劑的樣品的Ca-ATPase活性雖然整體上呈下降趨勢，但其下降程度比對照樣低。凍藏12周后，其活性分別為0.261 μmol(Pi)/（mg·min）、0.251 μmol(Pi)/（mg·min）和0.248 μmol(Pi)/（mg·min），均明顯高于對照樣，3種抗凍劑的作用效果相當，以上結果從另外一個角度說明在凍藏過程中，白姑魚魚糜的肌球蛋白尤其是肌球蛋白頭部發(fā)生了嚴重的變性，添加各種抗凍劑可較好地抑制其冷凍變性，其中海藻糖和乳酸鈉的抗凍效果可與商業(yè)抗凍劑比擬，可以在工業(yè)化生產(chǎn)中單獨應用或復配使用。海藻糖和乳酸鈉都屬于低甜度、低熱值物質，因此在魚糜加工業(yè)中有望成為傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑的替代物。

圖4 抗凍劑對白姑魚魚糜在-20℃凍藏過程中凝膠強度的影響Fig.4 EffectofcryoprotectantsonArgyrosomusargentatus Surimigelstrengthenduringfrozen-storageat-20℃

圖5 抗凍劑對白姑魚魚糜在-18℃凍藏過程中肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性的影響Fig.5 Effect of cryoprotectants on the Ca-ATPase activity Argyrosomus argentatus surimi during frozen-storage at-18℃

3 結論

白姑魚魚肉蛋白質含量高，且色素蛋白含量低，能夠滿足魚糜的加工要求；加工成魚糜后，蛋白含量提高了8.02%，灰分和脂肪含量分別比魚肉降低了72.91%和57.74%，說明漂洗過程中去除了魚肉中大部分脂肪和鹽類。

白姑魚肌肉各組分蛋白含量之間差異明顯，含量最高的是肌原纖維蛋白，其次是堿溶性蛋白、肌漿蛋白、非蛋白氮和基質蛋白；加工成魚糜以后，由于經(jīng)過漂洗工序，蛋白組分比率發(fā)生了變化，肌原纖維蛋白的含量相對升高，而非蛋白氮和肌漿蛋白含量大大降低。

在-30℃、-20℃和-10℃不同溫度下凍藏時，肌原纖維蛋白都容易發(fā)生變性，并且凍藏溫度越高變性速度越快，而凝膠強度則隨著凍藏時間的延長呈明顯下降趨勢。魚糜微觀結構顯微鏡照片顯示，魚糜在-10℃凍藏16周后，魚糜凝膠結構雜亂，組織間空隙明顯，冰晶顆粒較大。-20℃凍藏時，魚糜結構顯示出一定的規(guī)律，冰晶顆粒較??；-30℃凍藏后，魚糜結構致密，冰晶排列呈規(guī)律分布，顆粒很小，說明魚糜凍藏過程中，冰晶的形成和增長可能造成了魚肉蛋白的變性。

凍藏過程中，研究了海藻糖、乳酸鈉對白姑魚魚糜蛋白的抗凍效果，結果表明抗凍效果可與商業(yè)抗凍劑比擬，可以在工業(yè)化生產(chǎn)中單獨應用或復配使用。

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