馮福民,郝金奇,陳 怡,孫淑豐,鄭國(guó)穎,陳 剛

(華北煤炭醫(yī)學(xué)院:1.流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)科,河北省煤礦衛(wèi)生與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.護(hù)理學(xué)系中心實(shí)驗(yàn)室,河北唐山063000)

遺傳學(xué)研究表明肺結(jié)核發(fā)病是多基因與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。國(guó)內(nèi)外學(xué)者分別對(duì) NRAM P1[1]、VDR[2]、MBP[3]、HLA[4]等基因的多態(tài)性與人群肺結(jié)核病發(fā)病的相關(guān)性進(jìn)行了研究,但是,現(xiàn)有研究主要考察了單個(gè)基因與肺結(jié)核病易感性的關(guān)系,存在較大的局限性,基因與基因之間可能存在的交互作用尚未得到有效論證。尤其是對(duì)于復(fù)雜性狀的慢性病,基因和環(huán)境因素的交互作用在其中扮演著十分重要的“角色”認(rèn)識(shí)不清。本研究在分別探討VDR基因和MBP基因與人群肺結(jié)核發(fā)病的基礎(chǔ)上,著重分析兩個(gè)基因在肺結(jié)核發(fā)生中是否存在交互作用及其作用方向和大小。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 病例組182例來(lái)自2006年8月至2007年12月經(jīng)唐山市結(jié)核病醫(yī)院確診的漢族成年新發(fā)肺結(jié)核患者。全部病例按照1998年修訂的《中國(guó)結(jié)核病分類法》標(biāo)準(zhǔn)診斷,年齡大于或等于18歲;除外慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌、塵肺、肺炎、糖尿病、長(zhǎng)期使用腎上腺皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑、HIV感染等免疫功能低下者。對(duì)照組190例來(lái)自唐山市健康體檢中心,與病例同期的漢族成年健康體檢者。經(jīng)PPD試驗(yàn)確認(rèn)有結(jié)核分支桿菌感染,年齡大于或等于18歲,與納入的病例或?qū)φ諢o(wú)血緣關(guān)系,排除標(biāo)準(zhǔn)與病例相同。

1.2 研究?jī)?nèi)容和方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 按照文獻(xiàn)資料提供的信息及本研究的設(shè)計(jì)要求統(tǒng)一設(shè)計(jì)調(diào)查表,征得研究對(duì)象知情同意,現(xiàn)場(chǎng)詢問(wèn)其一般情況,煙酒、衛(wèi)生、飲食等生活習(xí)慣,家庭經(jīng)濟(jì)、住房狀況,本人疾病史、結(jié)核患者接觸史、卡介苗接種史,家族結(jié)核病史等。

1.2.2 基因多態(tài)性分析 采集研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL,EDTA抗凝。采用鹽析法提取人基因組DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)和基因庫(kù)中人類VDR和MBP基因序列特征,借助 primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物,送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,其基因位點(diǎn)和引物序列為:VDR TaqⅠ位點(diǎn),454 bp,5′-caa cca aga cta ca agt acc gcg tca gtg 和 5′-ctg gaa gga gag gca gcg gta ctg;VDR Apa Ⅰ 位點(diǎn),1 935 bp,5′-caa cca aga cta caa gta ccg cgt cag tg 和 5′-gag cac aag ggg cgt tag ctt cat g;VDR Fok Ⅰ 位點(diǎn),267 bp,5′-agc tgg ccc tgg cac tga ctc tgg ctc和 5′-atg gaa aca cct tgc ttc ttc tcc ctc;MBP 52 位點(diǎn),351 bp,5′-ggc ttc cca ggc aaa gat ggc(特異位點(diǎn) C 引物)、5′-ggc ttc cca ggc aaa gat ggt(特異位點(diǎn) T引物)和5′-tct tga acc tgg tgc cat ccc tac tg;MBP 54 位點(diǎn),273 bp,5′-cag att gta gga cag agg gca tgc tc和 5′-tcc ccc ttt tct c(t)c ctt ggt gc(特異位點(diǎn)G 引物)、5′-tcc ccc ttt tct c(t)c ctt ggt gt(特異位點(diǎn) A 引物);MBP 57 位點(diǎn),285 bp,5′-cag att gta gga cag agg gca tgc tc 和 5′-cac gta cct ggt tcc ccc ttt tct c(特異位點(diǎn) G 引物)、5′-cac gta cct ggt tcc ccc ttt tct t(特異位點(diǎn)A引物)。

表1 基因-基因交互作用的 Logistic回歸分析結(jié)果

VDR基因3個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性采用PCR-RFLP方法分析,分別是TaqⅠ(TT型:454 bp;T t型:454 bp,293 bp,161 bp;tt型:293 bp,161 bp)、ApaⅠ(AA型:1 935 bp;Aa型:1 935 bp,1 647 bp,288 bp;aa型:1 647 bp,288 bp)和FokⅠ(FF型:267 bp;Ff型:267 bp,197 bp,69 bp;ff型:197 bp,69 bp)。M BP基因3個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性分析采用特異引物法,利用各個(gè)位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,單一特異引物擴(kuò)增陽(yáng)性者為純合子,兩個(gè)特異引物擴(kuò)增均陽(yáng)性者為雜合子,同時(shí)以P54上游引物和P52下游引物組合擴(kuò)增的574 bp片段作為質(zhì)控來(lái)證實(shí)PCR反應(yīng)的有效性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù),單因素、多因素、交互作用分析采用SPSS11.5軟件完成。使用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡分析采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的基本特征及均衡性分析 病例組(男122例,女60例)和對(duì)照組(男132例,女58例)性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.256,P=0.613)。病例組(42.74±14.79)歲和對(duì)照組(45.86±16.26)歲年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.931,P=0.054)。兩組研究對(duì)象的農(nóng)村和城市居住地差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.137,P=0.154)。表明兩組人群性別、年齡、城鄉(xiāng)居住地均衡,具有可比性。對(duì)照組VDR和MBP基因型別的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明擬合優(yōu)度優(yōu)良(觀察值與期望值差別較小,χ2值介于 0.4～2.4之間,P＞0.05),說(shuō)明對(duì)照人群處于平衡狀態(tài),具有良好的代表性,可以從基因頻率來(lái)估計(jì)基因型頻率。

2.2 病例組和對(duì)照組一般情況的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示,肺結(jié)核患者接觸史(OR=7.423,95%CI:3.565～15.657)、肺結(jié)核家族史(OR=3.938,95%CI:1.956～7.926)、重體力勞動(dòng)(OR=1.800,95%CI:1.010～3.208)為肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素,有卡介苗接種史(OR=0.632,95%CI:0.473～0.821)、有卡痕(OR=0.535,95%CI:0.384～0.856)為肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)因素。

2.3 VDR、MBP基因多態(tài)性與肺結(jié)核發(fā)生的關(guān)系 病例組中,TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ、P52、P54位點(diǎn)的突變型純合子分別占0.0%、7.7%、31.9%、4.9%、0.5%,雜合子分別為占 8.2%、46.7%、37.4%、7.7%、12.6%;在對(duì)照組中,其突變型純合子分別占 1.0%、7.4%、30.0%、2.1%、1.1%,雜合子分別為占11.1%、41.6%、32.1%、3.7%、10.5%。在基因多態(tài)性位點(diǎn)與肺結(jié)核發(fā)病的單因素非條件Logistic回歸分析中,TaqⅠ、P52、P54的純合子突變率低,與雜合子型合并分析。P57位點(diǎn)突變率不足1%,未進(jìn)行分析。以野生型為參照,未發(fā)現(xiàn)VDR基因 TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ位點(diǎn)和MBP基因P54位點(diǎn)多態(tài)性在病例組和對(duì)照組的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。僅P52位點(diǎn)的多態(tài)性與肺結(jié)核的發(fā)生有關(guān)(β=0.856,S.E=0.382,Wald χ2=5.011,P=0.025,OR=2.354,95%CI為:1.112～4.981)。多因素非條件 Logistic回歸分析結(jié)果顯示控制了上述5個(gè)變量的協(xié)同作用后,MBP基因P52位點(diǎn)多態(tài)性仍然與肺結(jié)核的發(fā)生有關(guān)(β=0.845,S.E=0.395,Wald χ2=4.582,P=0.032,OR=2.329,95%CI為:1.074～ 5.050),未發(fā)現(xiàn)VDR和其他MBP基因位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核的發(fā)生相關(guān)。

為了探討VDR和MBP基因各位點(diǎn)基因型不同組合對(duì)肺結(jié)核發(fā)生危險(xiǎn)性的影響分析,本文應(yīng)用多因素Logistic回歸軟件對(duì)這5個(gè)基因位點(diǎn)的不同組合進(jìn)行了交互作用分析,3個(gè)及以上位點(diǎn)的組合分析均未見(jiàn)交互作用,兩兩基因位點(diǎn)間的交互作用結(jié)果見(jiàn)表1,同時(shí)對(duì)有交互作用的位點(diǎn)進(jìn)行叉生分析,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 VDR和M BP基因相關(guān)位點(diǎn)多態(tài)性的叉生分析

結(jié)果顯示,VDR基因FokⅠ與 ApaⅠ、FokⅠ與MBP基因P52位點(diǎn)多態(tài)性之間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是,兩個(gè)基因間3、4、5個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性之間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以FokⅠ野生基因型FF為參照,FokⅠ雜合子攜帶者與ApaⅠ雜合子之間表現(xiàn)為相乘作用,對(duì)ApaⅠ雜合子與結(jié)核病之間的聯(lián)系具有增強(qiáng)作用,危險(xiǎn)性提高2.5倍。但P52基因Ct+tt與FokⅠ基因Ff之間的叉生分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的聯(lián)系。

3 討 論

VDR和MBP均是體內(nèi)重要的細(xì)胞因子,活性水平在人群中分布不均[5],其基因多態(tài)性與機(jī)體的感染和炎癥有關(guān)[6]。而肺結(jié)核作為一種慢性感染性疾病,影響其發(fā)病的因素很多,但主要?dú)w結(jié)為環(huán)境因素和遺傳因素2大類。本研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者接觸史、卡介苗接種史、卡痕、重體力勞動(dòng)、結(jié)核病家族史與肺結(jié)核的發(fā)病有關(guān),與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)論大體一致。

在單一基因位點(diǎn)突變研究中僅發(fā)現(xiàn)P52位點(diǎn)突變基因型攜帶者發(fā)生肺結(jié)核的危險(xiǎn)性高于野生型基因攜帶者,提示MBP基因突變可影響巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌的活性[7],導(dǎo)致宿主淋巴細(xì)胞對(duì)結(jié)核菌素的反應(yīng)性下降[8]。但不同種族的基因型特征存在明顯的差異,在非洲[9]、印度[10-11]的研究就得出了3種截然相反的結(jié)論。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)唐山地區(qū)漢族人VDR基因的FokⅠ、ApaⅠ和TaqⅠ位點(diǎn)突變與肺結(jié)核的關(guān)聯(lián),提示這些易感基因型單獨(dú)存在時(shí)并不能增加肺結(jié)核的患病風(fēng)險(xiǎn)。這與劉瑋等[12-13]在中國(guó)的漢族軍人和藏族人群中研究的結(jié)論不同;而與南非、西非、秘魯和居住在倫敦的印度人等地的研究結(jié)論一致[14-18]。

各研究結(jié)果之間的這種差異反映出結(jié)核病的易感性不是單一基因多態(tài)性所決定的,可能與地區(qū)、環(huán)境因素以及人種的不同相關(guān)聯(lián),也可能與各獨(dú)立研究的樣本量較少有關(guān)。某個(gè)基因位點(diǎn)的變異對(duì)最終導(dǎo)致肺結(jié)核的發(fā)生影響有限,所以也不難理解VDR基因多態(tài)性與肺結(jié)核無(wú)關(guān)的結(jié)論。

肺結(jié)核的發(fā)生與發(fā)展是多因素介入涉及多個(gè)基因改變多步驟的過(guò)程,多種“易感”基因型同時(shí)存在可能大幅度增加或降低肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)性。單個(gè)細(xì)胞因子基因多態(tài)性的研究常常會(huì)有不一致的結(jié)果,或者沒(méi)有顯示出與疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。肺結(jié)核發(fā)生全過(guò)程的多基因模型研究,比單個(gè)基因研究對(duì)個(gè)體易感性有更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià),但迄今為止,國(guó)外為數(shù)不多的多基因模型研究尚無(wú)確切的結(jié)論和通用的模式。國(guó)內(nèi)單個(gè)細(xì)胞因子基因多態(tài)性與肺結(jié)核關(guān)系的報(bào)道,結(jié)論尚不一致,多基因聯(lián)合分析至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)MBP基因P52位點(diǎn)與VDR基因的FokⅠ位點(diǎn)之間、VDR基因的FokⅠ與 ApaⅠ位點(diǎn)之間存在交互作用。同時(shí)攜帶FokⅠ雜合子和ApaⅠ雜合子者發(fā)生肺結(jié)核的危險(xiǎn)性是單一ApaⅠ雜合子攜帶者的3.5倍。叉生分析未能證實(shí)MBP基因P52突變型與VDR基因的FokⅠ突變型雜合子的交互作用大小和方向,可能是P52位點(diǎn)突變率較低,需要較大的樣本量來(lái)證實(shí)。因此,目前對(duì)基因與基因交互作用機(jī)制和生物學(xué)機(jī)制的研究樣本量往往有限,分析結(jié)果的敏感性和把握度有待提高。

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