張寶俊,劉海濤,張家榕,韓巨才,劉慧平

(1.山西農業(yè)大學 農學院,山西 太谷 030801;2.山西農業(yè)大學生命科學院,山西太谷 030801)

梨樹內生拮抗細菌的篩選及發(fā)酵條件的研究

張寶俊1,劉海濤1,張家榕2,韓巨才1,劉慧平1

(1.山西農業(yè)大學 農學院,山西 太谷 030801;2.山西農業(yè)大學生命科學院,山西太谷 030801)

以梨黑斑病菌(Alternaria alternata)為指示菌,從梨樹木質部分離的8株內生芽孢桿菌中篩選出一株抑菌效果最佳的拮抗菌株LP5。為明確該菌株在發(fā)酵生產中的最佳營養(yǎng)組分及發(fā)酵條件,運用單因素試驗和正交試驗方法測定了不同因素下LP5菌株發(fā)酵液的OD600值及其抑菌作用。研究結果表明:最有利于菌體生長及抗菌物質積累的營養(yǎng)條件是以含蔗糖1.5%,蛋白胨1.0%,酵母粉0.5%,NaCl 0.5%的液體培養(yǎng)液,最適發(fā)酵條件為30℃,pH 7.0,發(fā)酵培養(yǎng)48 h～72 h。

梨黑斑病菌;內生細菌;發(fā)酵條件;正交試驗

在利用植物內生細菌進行生物防治的研究中,以較低的成本獲得較多的拮抗產物是進行大規(guī)模工業(yè)化生產的基礎[1]。但由于生物菌體在發(fā)酵過程中受到營養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件、環(huán)境因素等多方面因素的限制,常常難以發(fā)揮其潛在的生物學功能,為使生物菌體在發(fā)酵生產中能夠分泌更多有益代謝產物,應當對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。李景良等[2]通過對植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)ZJ316菌株的營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化,使該菌株產細菌素的能力提高了2.3倍。王端好等[3]通過對氧化葡萄糖酸桿菌 (Gluconobacter oxydans)發(fā)酵條件的優(yōu)化,使該菌株的生物量比原條件下提高了50.6%,而且產生的脫氫酶比活力也有所提高。付莉等[4]通過對一株木醋桿菌(Acetobacter xy linum)發(fā)酵條件的優(yōu)化,使細菌纖維素的產量提高了30%,生產成本由11.7元/kg下降到3.51元/kg,為細菌纖維素的工業(yè)化生產提供了科學依據。

本研究以梨樹木質部分離的8株內生芽孢桿菌為研究對象,篩選出一株對梨黑斑病菌有較好抑制作用的菌株,并對其最適營養(yǎng)組分和發(fā)酵條件進行分析,目的在于使菌株最大程度上產生拮抗次生代謝物質,為菌株發(fā)酵產物的工業(yè)化生產提供試驗依據,為深入開發(fā)和利用生防芽孢桿菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

內生芽孢桿菌LP1～LP8菌株采集于山西農業(yè)大學果園健康梨樹側枝的木質部,經分離純化獲得,梨黑斑病菌 (Alternaria alternata)為山西農業(yè)大學農藥學實驗室保存菌種。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)液:酵母粉5 g;葡萄糖20 g;牛肉膏10 g;氯化鈉5 g;水1 000 mL;PDA培養(yǎng)基:葡萄糖20 g;馬鈴薯 200 g;瓊脂粉 18 g;水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌株篩選

對峙培養(yǎng)參照郭潤芳的方法[5],在PDA平板中央接入直徑 5 mm的梨黑斑病菌菌塊,周圍2 cm處接直徑5 mm細菌菌體2塊,25℃恒溫培養(yǎng)5 d,測定菌體對梨黑斑病菌的抑制率,以不接細菌菌體為對照。

代謝產物活性檢測:將各菌株接種于NA培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h獲得種子發(fā)酵液,按照1%接種量將供試菌株接種于基礎培養(yǎng)液中,28℃、150 r?min-1振蕩培養(yǎng)72 h,10 000 g離心10 min去除菌體,分兩種方式處理發(fā)酵液,方法一:0.45 μ m微孔濾膜過濾滅菌;方法二:121℃濕熱滅菌30 min。

采用生長速率法測定各菌株發(fā)酵液活性,將1 mL發(fā)酵液與9 mL PDA培養(yǎng)基混合制備平板,接入直徑5 mm新鮮的梨黑斑病菌菌塊,5 d后測定抑菌率,對照以無菌水替代發(fā)酵液。

1.2.2 最佳碳源篩選

以1.2.1中篩選的菌株為研究對象,以NA培養(yǎng)液活化菌株,按照1%接種量接種,分別以蔗糖、淀粉、甘露醇、乳糖、麥芽糖、果糖、木糖替換基礎培養(yǎng)基中的碳源,于28℃、150 r?min-1培養(yǎng)24、48、72 h后,測定不同碳源對菌體生長及抗菌物質積累量的影響。

1.2.3 最佳氮源篩選

以蛋白胨、尿素、硝酸銨、酵母、谷氨酸、甘氨酸、酵母+蛋白胨 (0.5∶1)、牛肉膏+蛋白胨(0.5∶1)替換基礎培養(yǎng)基中的氮源,于28℃、150 r?min-1發(fā)酵培養(yǎng)24、48、72 h后測定不同氮源對菌體生長及抗菌物質積累量的影響。

1.2.4 最佳培養(yǎng)條件分析

建立pH值、溫度、N、C四因素三水平的正交試驗,設九種組合方式。碳源分別設 1.5%、2.0%、2.5%三個含量;氮源分別設 1.0%、1.5%、2.0%三個含量;pH分別設5.0、7.0、9.0三個處理;溫度分別設25、30、35℃三個處理,于150 r?min-1發(fā)酵培養(yǎng)72 h后測定不同發(fā)酵條件下發(fā)酵液的OD600值及抑菌作用。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株篩選

經對峙培養(yǎng)檢測,分離的8株內生細菌菌體對梨黑斑病菌抑菌率最高的為 LP4,抑制率達77.6%;其次為 LP1、LP3、LP5,抑制率均為77.4%,但與LP4菌株抑制率的差異不顯著;LP2、LP6、LP7和LP8 4個菌株對梨黑斑病菌的抑制率在60%～70%之間,與LP4菌株抑制率的差異達到顯著水平 (表1)。

表1 8個菌株對梨黑斑病的拮抗作用Table 1 Antagonism of 8 strains to Alternaria alternate

表1結果表明,8個菌株的次生代謝物質對梨黑斑病菌均有強烈的抑制作用。其中LP5菌株發(fā)酵液的抑菌效果最佳,對梨黑斑病菌的抑制率達92.6%,且發(fā)酵液滅菌處理后仍保留64.8%的抑菌活性 (表1),表明該菌株可能包括對熱敏感的蛋白酶類和熱穩(wěn)定性較好的抗生素類等多種抗菌物質。綜合分析細菌菌體及其代謝產物的抑菌活性,初步篩選出LP5為一株對梨黑斑病菌有拮抗作用的潛在生防菌株,后續(xù)發(fā)酵條件的優(yōu)化以此菌株為研究對象。

2.2 最佳碳源及氮源的篩選

2.2.1 不同碳源對菌體生長及抗菌物質積累量的影響 (圖1)

圖1 不同碳源對LP5菌株菌體生長的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on growth of strain LP5

圖1結果顯示,以木糖為碳源時,發(fā)酵24、48、72 h,其發(fā)酵液的OD600值僅為 0.01、0.06、0.12,表明該菌株對木糖的利用率低,另7種碳源能明顯提高菌體的生長,發(fā)酵48 h后發(fā)酵液OD600值在0.318～1.672之間,且發(fā)酵 48 h后發(fā)酵液OD600值顯著高于24 h的OD600值,但與72 h時發(fā)酵液的OD600值差異不明顯,表明24～48 h可能是菌體快速增長期。結果表明,碳源對菌體生長量的影響依次為麥芽糖＞蔗糖＞甘露醇＞乳糖＞葡萄糖＞淀粉＞果糖＞木糖。

碳源對抗菌物質積累量的影響依次為蔗糖＞麥芽糖＞甘露醇＞葡萄糖＞乳糖＞淀粉＞果糖＞木糖。發(fā)酵72 h后,發(fā)酵液對梨黑斑病菌的抑制率分 別 為 78.5%、67.7%、64.6%、53.3%、52.9%、40%、15.4%和0.9%,結果如圖2所示。

圖2 不同碳源對LP5菌株抗菌物質積累量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on antagonistic substance of strain LP5

圖2結果表明,麥芽糖對菌體的生長最為有利,但產生抗菌物質最多的是蔗糖,二者對菌體生長量的影響差異不顯著,但對抗菌物質積累量的影響達到極顯著水平 (組內F值為625.57**)

因此,綜合考慮碳源對菌體生長和抗菌物質積累量二因素的影響,初步篩選出蔗糖為該菌株發(fā)酵的最適碳源。

2.2.2 不同氮源對菌體生長及抗菌物質積累量的影響 (表2)

表2 不同氮源對菌株生長和抗菌物質積累量的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on growth and antagonistic substance of strain LP5

結果表2表明,不同氮源對菌體生長和產抗菌物質的影響差異顯著,以硝酸銨為氮源,發(fā)酵24 h、48 h、72 h后,菌體均不能生長,以尿素、谷氨酸、甘氨酸為氮源,菌體生長和抗菌物質積累量均很小,發(fā)酵72 h后OD600值僅為 0.028、0.057和 0.574,發(fā)酵液抑菌率分別為 13.9%、7.8%、17.8%,以酵母、蛋白胨、牛肉膏+蛋白胨、酵母+蛋白胨、酵母+牛肉膏為氮源,菌體生長和抗菌物質積累量均明顯提高,72 h后發(fā)酵液OD600值均大于1.0,抑菌率大于50%。無以酵母+蛋白胨(0.5∶1)為氮源時發(fā)酵液OD600值和抑菌率均為最大值,分別為1.643和64.6%。因此,篩選出酵母+蛋白胨 (0.5∶1)為該菌株發(fā)酵的最適氮源。

2.3 不同發(fā)酵條件對菌體生長及抗菌物質積累量的影響 (表3)

表3 LP5菌株發(fā)酵條件正交試驗因素水平結果Table 3 The result of orthogonal experiment of the strain LP5 fermentation condition

表3結果表明,初始pH值對LP5菌體生長及抗菌物質積累量的影響最為明顯,1、8、9組合 (pH 5.0)中,菌體發(fā)酵培養(yǎng)72 h后的OD600僅為0.213、0.165、0.286,抑菌率低于5%。其余3因素對LP5菌體生長及抗菌物質積累量也有一定得影響。由R值分析表明,影響程度依次為pH、C源、N源和溫度。正交分析結果表明,該拮抗菌株最適培養(yǎng)組分為含蔗糖1.5%、蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%、NaCl 0.5%的液體培養(yǎng)液,最適發(fā)酵條件為30℃、pH 7.0時振蕩培養(yǎng)48～72 h。

3 結論與討論

芽孢桿菌作為一類潛在的生物農藥資源已受到各國學者的廣泛關注。目前包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟質芽孢桿菌 (Bacillus cereus)、地衣芽孢桿菌 (Bacillus lichenif ormis)、解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquef aciens)等多類芽孢桿菌已商品化。但為提高細菌殺菌劑防治效果、降低生產成本,需對生防菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,并建立適宜的工藝流程。目前,關于生防芽孢桿菌發(fā)酵條件的研究報道較多[6～8],如任爭光等[9]研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌BJ-6產生抗菌物質的最適培養(yǎng)組分為含麥芽糖2%、蛋白胨1%、麩皮1%、CaCO31%、Na2HPO30.2%和KH2PO30.1%的培養(yǎng)液;發(fā)酵條件的30～35℃、起始pH 9.0、發(fā)酵培養(yǎng)60 h。王芳等[10]為提高拮抗菌株B36發(fā)酵生產的菌體量和抗菌物質的產率,通過單因子試驗和正交試驗方法,確定了最佳培養(yǎng)組成為含葡萄糖2.0%、酵母粉0.5%、大豆粉0.5%、NH4NO30.5%的液體培養(yǎng)液;最適發(fā)酵條件為28℃、pH 9.0條件下150 r?min-1發(fā)酵培養(yǎng)36 h。楊華等[11]建立了1株蘋果輪紋病拮抗細菌的最佳培養(yǎng)組成和培養(yǎng)條件,在含酵母浸膏0.5%、蔗糖2%、蛋白胨1%的液體培養(yǎng)液中28℃、pH 7.0,振蕩培養(yǎng)96 h最有利于菌體生長,并且分析出菌體在酸性條件下 (pH 4.0)幾乎不生長。本試驗也測定出拮抗細菌LP5菌株在酸性條件下 (pH 5.0)菌體的生長量很小,與楊華等人的研究結果相近。

本試驗以含菌量、抗菌物質的抑菌率兩個指標分析了LP5菌株的發(fā)酵條件,研究表明該菌株的菌體生長量與其分泌抗菌物質的量存在一定的相關性,但不成正比,這與沈錦玉[12]的研究結果一致,因此要獲得大量抗菌物質,應綜合考慮菌體生長與抗菌物質分泌量間的關系。本研究僅從C源及N源含量、溫度、初始pH四個主要方面分析了該菌株的發(fā)酵條件,通氣量、接菌量、微量元素等因素對菌體生長及抗菌物質的分泌量的影響有待于進一步的研究。

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Screening and Study on Fermentation Conditions of Endophytic Antifungal Bacteria Isolated from Pear Plant

ZHANG Bao-jun1,LIU Hai-tao1,ZHANGJia-rong2,et al.
(1.College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China;2.College of Life Science,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)

WithAlternaria alternataas indicator,the strain LP5 was screened from eight strains of endophyticBacillus sp.,which were isolated from xylem of pear plant.To confirm the optimal components and cultural conditions of strain LP5,the antifungal activity and OD600of the strain LP5 were studied by the method of single factor and orthogonal design.Results showed that the optimal cultural liquid medium was composed of 1.5%sucrose,1.0%protein peptone,0.5%gyeast extract,0.5%NaCl,and the optimal fermentation conditions were 30℃,pH 7.0 and culturing for 48～72 h.

Alternaria alternata;Endophytic bacteria;Fermentation condition;Orthogonal design

S482.8

A

1671-8151(2010)01-0014-05

2009-09-07

2009-11-08

張寶俊 (1979-),男 (漢),山西新絳人,博士研究生,主要從事病蟲害抗藥性及生物農藥方面的研究。

劉慧平,教授,碩士生導師。Tel:0354- 6288344;E-mail:sxndlhp@yahoo.com.cn

山西省留學歸國基金 ( 2007061;2009043);山西省科技攻關項目 (2007031039);山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項目(20093057)

(編輯:楊忠義)