葉 芬，蔡家利

（1.西南大學動物科技學院，重慶 400715；2.重慶理工大學化學與生物工程學院，重慶 400050）

1 病毒基因組結構及其編碼的主要蛋白

1.1 病毒的基因組結構和特點 PCV基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子，根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核酸序列，將PCV分為PCV1和PCV2兩個血清型。PCV1的基因組全長為1 759bp，基本沒有致病性，PCV2的基因組全長為1767bp或1768bp。兩個血清型的核苷酸的同源性低于80%，由基因序列推出的氨基酸的序列同源性小于76%。PCV2分離株間核苷酸的同源性大于94%，而PCV1分離株間核苷酸的同源性大于99%。

PCV基因組中含有圓環(huán)病毒所特有的莖環(huán)結構（Stem-loop structure），它是一保守的9核苷酸基序，序列為 TAGTATTAC（PCV1）或 AAGTATTAC（PCV2），這一序列對病毒DNA的復制非常關鍵，DNA的環(huán)復制就是從這里開始。莖環(huán)結構下游有4個六聚體重復（5′-CGG-CAG-3，H1 H2 H3 H4），這些序列是病毒復制酶蛋白的結合位點。

Hamel等（1998）應用軟件對PCV基因組進行分析，發(fā)現(xiàn)PCV1和PCV2均可能含有11個開放閱讀框（ORF）。其中 ORF1、2、3、4、7和 8具有一定的同源性，其余ORFs無任何同源性。編碼的蛋白大小從36 kDa～2 kDa不等?，F(xiàn)已證實，PCV有兩個主要的閱讀框:ORF1和ORF2，二者在長度上都大于600bp。ORF1編碼與病毒復制相關的Rep蛋白，該蛋白氨基酸序列相當保守，是PCV1和PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因；而ORF2編碼病毒的主要結構蛋白Cap，它是主要的免疫蛋白。

PCV2基因組的11個閱讀框大小相差懸殊（見表1）。其中 ORF1、ORF5、ORF7、ORF10，5′～3′方向相同；ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11，5′～3′方向相同。這些閱讀框表現(xiàn)為重疊基因，從而充分利用了圓環(huán)病毒有限的遺傳物質(zhì)，這可能是生物進化過程中自然選擇的結果。

表1 PCV2基因組的閱讀框概況

1.2 病毒編碼的主要蛋白

1.2.1 Rep蛋白 Rep蛋白與病毒基因組的滾環(huán)復制相關，由PCV最大的開放閱讀框ORF1編碼，分子量為 35.6 kDa（PCV1） 或 35.8 kDa（PCV2），由 312 aa（PCV1）或 314 aa（PCV2）組成。PCV1與 PCV2的蛋白氨基酸序列同源性達86%，這也是兩種血清型PCV產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因所在。PCV1的Rep蛋白僅有 1 個糖基化位點，位于 20 aa～22 aa（NPS）；PCV2 的Rep蛋白則含有3個糖基化位點，位于23 aa～25 aa(NPS)，256aa～258aa（NQT）及 286aa～288aa（ZAT）。Rep蛋白具有與典型滾環(huán)復制（RCR）相關的3個保守基序Ⅰ（FTLNN）、Ⅱ（HLQG）、Ⅲ（YCSK）以及結合 dNTPs的P環(huán)（P-LOOP）結構（序列為G-GKS），這些結構對維持Rep蛋白的功能至關重要，突變或缺失均會影響病毒的復制，這也進一步證明了PCV DNA是滾環(huán)式復制。Rep蛋白在所有圓環(huán)病毒中相對保守。系統(tǒng)發(fā)生學分析表明，圓環(huán)病毒的Rep蛋白可能是植物病原Nanovirus的Rep蛋白與小RNA樣病毒（如嵌杯樣病毒）RNA結合蛋白或原核生物的解旋酶發(fā)生重組的結果。

1.2.2 Cap蛋白 實驗證明ORF2編碼病毒的結構蛋白（Cap蛋白），它是病毒的主要結構蛋白，構成病毒的核衣殼，在病毒感染細胞后在宿主各種酶的參與下產(chǎn)生。PCV1與PCV2的Cap蛋白均由233aa組成，氨基酸同源性僅為64%。兩種病毒的Cap蛋白都只有單一的糖基化位點，分別位于PCV2 Cap的143 aa～145aa（NYS）及 PCV1 的 102aa～104 aa（NYS）。

Nawagitgul等將ORF2基因克隆后于昆蟲細胞中表達，表達產(chǎn)物的分子量為30 kμ，與從純化的病毒粒子中監(jiān)測到的蛋白大小相似，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)表達產(chǎn)物能自動組裝成病毒核衣殼樣顆粒，從而進一步證實ORF2基因編碼病毒的核衣殼蛋白。血清學實驗顯示，兩種血清型的Cap蛋白沒有抗原交叉性，這可能是因為這個共同抗原位點給整個Cap蛋白給掩蓋了。通過多肽掃描還發(fā)現(xiàn)，PCV2 Cap蛋白上存在三個特有的抗原位點（65aa～87aa，113aa～139aa及 193aa～207aa），這為建立特異性檢測PCV2的血清學方法奠定了基礎。目前，對PCV研究較深入的為ORF1和ORF2，同時由于ORF2的以上特性，其編碼產(chǎn)物就成為分子水平上診斷PCV的理想抗原，ORF2也成為研制基因工程疫苗的首選基因。因此，ORF2的研究已成為PCV2研究的熱點。

2 PCV2分子免疫學特性

有研究表明，PCV2能夠在其不復制或降解的情況下持續(xù)存在于DC細胞中，這種沉默病毒的感染同時提出了免疫逃避和DCs降解機制，而由于具有遷移能力，感染病毒的DCs是一種潛在的可在宿主體內(nèi)不需要復制就能傳播病毒的工具。Shibahara等也證實PCV2可以誘導淋巴系統(tǒng)中B細胞凋亡，使得抗原遞呈細胞遞呈抗原的能力減弱，同時降低了B淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的機能，因此PCV可以導致豬的免疫抑制。由于PCV2導致細胞因子mRNA表達失調(diào)，尤其是胸腺Ⅱ-10mRNA水平上升，必然嚴重損害豬群的免疫系統(tǒng)，從而為其他病原的侵襲創(chuàng)造了有利條件。

3 與分子生物學相關的檢測方法研究進展

3.1 ELISA方法 林彥星等應用原核表達的PCV2衣殼（Cap）蛋白作為診斷抗原，初步建立了一種檢測PCV2抗體的間接ELISA方法。實驗表明該方法具有較高的敏感性和特異性，適于大規(guī)模檢測PCV2血清抗體的流行病學調(diào)查。秦承學等將PCV2 ORF1和ORF2基因分別插入桿狀病毒和大腸桿菌表達系統(tǒng)，用親和層析方法提純獲得重組衣殼（Cap）與復制（Rep）蛋白，用細胞融合技術獲得2株Cap和Rep蛋白單克隆抗體，以重組Cap和Rep蛋白作為抗原，通過反應重要條件的優(yōu)化，建立了間接ELISA方法，有較好的特異性和重復性，可用于PCV2抗體檢測和疫苗免疫抗體鑒別診斷。

3.2 間接免疫熒光試驗（IFA） 1998年Allan等將組織病料在PK215細胞中進行培養(yǎng)，用兔抗PCV高免血清培養(yǎng)細胞中的PCV進行反應，利用間接免疫熒光法對PCV進行檢測和分型。該方法具有良好的特異性和敏感性，可滿足流行病學調(diào)查、臨床監(jiān)測和疫苗抗體水平檢測的需要。

3.3 PCR方法 PCR法是一種診斷快速和特異性高的診斷方法。目前用于PCV診斷的PCR法主要有常規(guī)PCR、復合PCR、套式PCR、競爭PCR等方法。Quintana等對18種豬商品疫苗用PCR檢測PCV1和PCV2，結果發(fā)現(xiàn)所有疫苗中未含有PCV2 DNA，僅有其中兩種疫苗檢出PCV1。此結果證明，PCR是檢測疫苗產(chǎn)品中是否含有外源PCV的快速敏感的方法，可用于豬疫苗質(zhì)量控制。馮志新等研究設計合成了一套引物和TaqMan探針，特異性擴增PCV2-ORF2基因，通過反應條件的優(yōu)化，建立了快速定量檢測PCV2的實時PCR方法。該方法具有較好的特異性和重復性，對PCV2 DNA檢測的下限為1拷貝/μL，敏感性比常規(guī)PCR高106倍。

目前在規(guī)模化、集約化豬群中發(fā)生多病原混合感染、繼發(fā)感染的情況越來越常見，其中PCV2、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬細小病毒（PPV）是較易混合感染的DNA病毒，常見于臨床病例中。由于多重PCR技術可在一份樣品中同時檢測多種病原體，且特異性和敏感性高，檢測時間短、成本低，在國外已作為一種新的檢測方法被應用于臨床病例的檢測中。Lee Chulseung等構建了可檢測和區(qū)分PRV、豬細胞巨化病毒（PCMV）和PCV2的多重PCR方法，此法對其他病毒、細菌和所用的Vero細胞未見有非特異性反應，適用于檢測供異種組織器官移植的豬樣品中的這些病毒。

3.4 原位雜交（ISH）技術 ISH具有高度敏感性，在國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種方法。應用ISH既可以對PCV1和PCV2進行分型，又可以檢測PCV與其他病毒的混合感染。劉方娜等根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）基因序列，在ORF2內(nèi)設計1對特異性引物，利用PCR反應擴增出371 bp的核酸片段，回收并純化PCR產(chǎn)物，用地高辛標記，建立了地高辛標記核酸探針診斷PCV2的方法。該探針與8個PCV2重組菌的核酸抽提物均能發(fā)生特異性雜交，而與對照組豬圓環(huán)病毒Ⅰ型（PCV1）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）的核酸雜交均為陰性；對PCV2 DNA的最低檢測量為10pg。

4 結語

自豬圓環(huán)病毒（PCV）發(fā)現(xiàn)以來，各國學者對其進行了深入研究。目前，PCV2及由其引起的PMWS等疾病已成為當今的研究熱點，也取得了不小的進展，但仍有許多問題尚待解決。由于目前仍然無有效的措施來防制豬圓環(huán)病毒病，所以仍需對PCV的分子生物學特性進行深入研究，以進一步弄清病毒基因組各ORFs及其編碼的蛋白質(zhì)的結構與功能、病毒的免疫學特性以及病毒的致病機理等，為PCV2的弱毒疫苗、亞單位疫苗以及重組活載體等疫苗的研制奠定堅實的理論基礎，力爭從根本上解決該病的防制問題。

[1]Hamel A L，Lin L L，Nayar G P.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs[J].J Virol，1998，72（6）：5262-5267.

[2]Nawagitgul P，Morozov I，Steven R B，et al.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].J Gen Virol，2000，81：2 281-2287.

[3]Mankertz A，Mankertz T，Wolf K，et al.Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus[J].J Gen Virol，1998，79：381-384.

[4]Ilyina T V，Koonin E V.Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replications from eubacteria，eukaryotes and archaebacteria[J].Nucleic Acids Res，1992，20：3279-3285.

[5]Darwichl L，Pie S，Rovira A，et al.Cytokine mRNA expression profiles in lymphoid tissues of pigs naturally affected by postweaning multisystemic wasting syndrome[J].J Gen Virol，2003，84（8）：2 117-2 125.

[6]林彥星，孫彥偉，劉鎮(zhèn)明，等.應用原核表達的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白建立一種間接ELISA診斷方法 [J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（3）：217-221.

[7]秦承學，姜 平，王先煒，等.表達豬圓環(huán)病毒2型Rep蛋白的重組桿狀病毒的構建與鑒定 [J].畜牧與獸醫(yī)，2007，39（10）：125.

[8]Quintana J，Segales J，Calsamiglia M，et al.Detection of PCV in commercial pig vaccines using PCR[J].Veterinary Journal，Netherlands，2006，171（3）：570－573.

[9]馮志新，姜 平，王先煒，等.豬圓環(huán)病毒2型TaqMan實時PCR檢測方法的建立 [J].中國病毒學，2006，21（4）：371－374.

[19]Lee C，Moon H J，Yang J，et al.Multip lex PCR for the simultaneous detection of pseudorabies virus，porcine cytomegalovirus and porcine circovirus in pigs[J].Journal of Virological Methods，2007，139（1）：39－43.

[11]劉方娜，刁有祥，王 妮，等.豬圓環(huán)病毒2型地高辛標記探針檢測方法的建立與應用 [J].中國獸醫(yī)學報，2008，28（7）：771-774.