浦津,何耀華,劉衛(wèi)華

(1.上海市閘北區(qū)市北醫(yī)院骨科,上海 200443;2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院骨科,上海 200233)

20世紀 90年代初 ,研究發(fā)現(xiàn)富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)中含有大量的生長因子,對骨的自然修復有良好的促進作用。其中以血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)和轉移生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)最為重要。近年來的研究表明 ,PRP有較強的成骨能力[1,2]。骨科界已將其引入骨重建領域。本實驗研究以兔橈骨缺損為模型,用 PRP與羥基磷灰石生物陶瓷復合進行骨缺損的修復 ,取得良好效果,報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔 12只(由新華醫(yī)院動物實驗中心提供),體重 2.5～ 3.1 kg,雌雄不限。采用自身對照方法,所有動物均在其雙前肢橈骨中下段連同骨膜制成長 1cm的骨缺損,選擇左側前肢為實驗側,右側前肢為對照側。實驗側缺損區(qū)植入 PRP和羥基磷灰石生物陶瓷(由北京華意健科貿(mào)有限公司生產(chǎn)),對照側缺損區(qū)單純植入羥基磷灰石生物陶瓷。

1.2 PRP的制作 動物麻醉后,用 10 mL注射器抽取 1 mL復方枸櫞酸鈉抗疑劑,再從兔耳中央動脈抽取 5 mL血液,搖勻,置入離心管中 ,離心(3650r/min)10min。液體分成上清液層和紅細胞層,吸取上清液及交界面以下 1～2 mm的紅細胞至另一離心管,再次離心(3000 r/min)10 min。棄去上清液上 3/4,剩余液體約 0.8mL,搖勻 ,即為 PRP。取 1個2mL注射器,依次吸入 0.8mL的 PRP,0.2mL凝血劑 (由1 mL10%的氯化鈣與 1000 U凝血酶混合組合而成)和 0.2 mL空氣(吸入空氣便于搖勻),搖勻,放置 10 s左右 ,制成PRP凝膠。整個 PRP的制作過程均需無菌操作。

1.3 手術方法 實驗動物術前 12 h禁食、禁水,局部脫毛,用 2%的硫噴妥鈉(30 mg/kg)兔耳靜脈麻醉后,取俯臥位。于雙前肢橈側中下段作 2 cm長皮膚切口,銳性分離顯露橈骨中下段,于中下段截骨 1cm(含骨膜),造成節(jié)段性橈骨骨缺損模型,生理鹽水沖洗傷口,壓迫止血,按計劃在左側缺損區(qū)植入 PRP和羥基磷灰石生物陶瓷,右側缺損區(qū)植入羥基磷灰石生物陶瓷,全層縫合皮膚切口。均不行內、外固定。

1.4 術后處理 術后常規(guī)飲食,完全負重并允許自由活動,術后 3 d青霉素(40萬 U/d)肌肉注射治療。術后 2、4、8和 12周分別處死 3只兔子進行觀察。

1.5 觀察指標

1.5.1 血小板計數(shù) 在 12只新西蘭大白兔取血制作 PRP過程中,用血紅蛋白吸管分別從裝有全血及 PRP的離心管中吸取樣本 10μL,血小板稀釋液稀釋后,高倍光鏡下人工計數(shù)。

1.5.2 生長因子濃度測定 采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法進行 TGF-β和 PDGF的濃度測定。

1.5.3 大體形態(tài)觀察 術后 2、4、8和 12周各時間點取骨缺損修復標本作大體觀察,觀察骨缺損修復程度,缺損交界面骨連接情況。

1.5.4 組織學觀察 術后各時間點取缺損區(qū)及兩端各 0.4 cm正常骨組織,標本置于 10%中性甲醛中固定,脫鈣,石蠟包埋,以缺損區(qū)為中心縱行切片,HE染色后,光鏡下觀察兩端及中央部位新骨生成情況。同時應用 MDGS圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析,統(tǒng)計新骨在缺損區(qū)所占的面積百分比。

1.5.5 射透電鏡 術后各時間點,所取標本經(jīng) 2.5%戊二醛固定液固定,4.13%乙二胺四乙酸二鉀脫鈣,1%鋨酸固定,0.5%醋酸鈾染色,脫水包埋。觀察新生骨細胞成熟度。

1.5.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)用 SPSS11.0軟件處理,樣本用(均數(shù)±標準差)表示。實驗側和對照側之間的差異用樣本均數(shù) t檢驗,以 P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

所有動物術后無感染和死亡,植入物無脫落,全部進入結果分析。傷口 2周愈合,無感染。兔全血中的血小板濃度為2.8× 105/mm3,PRP中血小板濃度為 9.325×105/mm3,PRP中血小板濃度為全血的 3.18倍。

2.1 生長因子濃度 兔全血的 TGF-β為(36.4±5.1)ng/mL,PDGF為 (149.5± 30.1)ng/mL;PRP中 TGF-β為(23.4± 5.8)ng/mL,PDGF為 (95.9± 12.5)ng/mL。

2.2 大體形態(tài)觀察 術后第 2周,實驗側和對照側人工骨與自體骨交界處及人工骨表面均以肉芽組織包裹連接,無明顯差異 ,實驗側肉芽組織量略多,且血供較為豐富。第 4周,實驗側在人工骨表面有較多骨痂生成,人工骨與自體骨交界面不清晰;對照側兩端僅有少量骨樣組織,人工骨表面有較多結締組織,而骨樣組織較少。第 8周,實驗側人工骨表面大部分被骨組織覆蓋,人工骨表面的腔隙已被充填;對照側骨組織少,骨痂限于人工骨兩端,表面的腔隙可見。第 12周,兩側骨組織形成量均增加,實驗側人工骨已被骨痂完全包裹;對照側人工骨中段仍有部分未被骨組織覆蓋。

2.3 X線片觀察 術后第 2周,兩側的人工骨與自體骨交界處斷端整齊,間隙清晰,實驗側斷端及缺損處骨密度略高于對照側。第 4周,實驗側骨缺損兩端可見均勻的高密度影,人工骨周圍骨痂已形成,骨折線模糊;對照側斷端處密度欠均勻,人工骨周圍未見明顯骨痂。第 8周 ,實驗側可見大量骨痂包繞人工骨表面,骨折線已消失;對照側斷端骨痂較前增多,靠近尺側的骨痂相對較為明顯,骨缺損處密度欠均勻。第12周時,兩側自體骨與人工骨交界處可見明顯骨性連接,實驗側人工骨外周同時見有皮質骨包繞,密度與正常骨相似,對照側人工骨表面仍有較多骨痂 (見圖 1)。

2.4 組織學觀察 第 2周,實驗側人工骨內纖維結締組織增生,纖維及軟骨性骨痂形成,可見纖維直接成骨及軟骨內骨化的方式形成網(wǎng)狀新生骨小梁,小梁邊緣覆以豐富的成骨細胞,骨基質內成骨細胞逐漸轉化為骨細胞,小梁間纖維組織內富于毛細血管;對照側纖維組織、毛細血管明顯少于實驗側 ,未見新生骨島、骨小梁。第 4周,實驗側纖維性軟骨性骨痂逐漸向骨性骨痂過渡,新生的骨小梁逐漸變得粗大,邊緣成骨細胞數(shù)量減少,不同成熟度的骨小梁排列成網(wǎng)架狀編織骨,斷端大量骨小梁通過;對照側人工骨空隙內骨組織稀疏,主要為纖維組織,斷端可見成骨。第 8周,實驗側斷端已被骨組織橋接,并逐漸形成板狀骨,人工骨空隙內可見大量新生骨組織生成替代,在應力的作用下出現(xiàn)骨的重建現(xiàn)象,原始哈佛氏管形成,外周見大量骨痂形成,并連成片狀;對照側新生骨主要集中在截骨端,骨小梁紊亂、不規(guī)則,成熟度較差,人工骨空隙內新生骨組織爬行距離較短。第 12周,實驗側人工骨完全修復,新生骨組織替代人工骨表面被皮質骨完全覆蓋,缺損中心區(qū)大量人工骨孔隙內見較成熟骨組織;對照側僅在截骨端見板層骨,缺損中心區(qū)大多數(shù)人工骨孔隙內無新生骨組織或骨組織成熟度較差 (見圖 2)。

圖1 術后 12周 X線片雙側骨缺損修復情況

圖2 術后 12周組織學觀察

2.5 射透電鏡觀察 術后第 2周,兩側破骨細胞較多,細胞內溶酶體較豐富,成骨細胞均較少,細胞表現(xiàn)較為幼稚,細胞內線粒體、內質網(wǎng)等細胞體器較少,且不活躍,細胞周圍膠原纖維均較少;但實驗側成骨細胞內線粒體和粗面內質網(wǎng)較多,細胞周圍膠原纖維也較對照側多,且排列整齊。第 4周 ,兩側的破骨細胞明顯減少,成骨細胞和細胞周圍膠原纖維明顯增多;實驗側成骨細胞數(shù)量多,表現(xiàn)較成熟,細胞內線粒體、內質網(wǎng)等細胞體器較豐富,細胞周圍膠原纖維較豐富,排列較為整齊;對照側成骨細胞少,細胞內線粒體、內質網(wǎng)等細胞體器相對少,膠原纖維少且排列紊亂。第 8周,兩側以成骨細胞為主,部分成骨細胞已向骨細胞轉化,可見板層骨雛形形成,未見破骨細胞;實驗側成骨細胞向骨細胞轉化較多,板層骨雛形較多,偶見局部鈣鹽沉積現(xiàn)象。對照側細胞周圍膠原纖維較豐富 ,排列紊亂。第 12周,實驗側以骨細胞為主,可見大量板層骨,骨陷窩形成,對照側以成骨細胞向骨細胞轉化型為主,板層骨已形成,但數(shù)量較少。

2.6 計算機圖像分析 用 SPSS11.0軟件處理后 ,均有統(tǒng)計學意義,光鏡下觀察兩端及中央部位修復性新骨生成情況。同時應用 MDGS圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析,統(tǒng)計新骨在缺損區(qū)所占的面積百分比。實驗側修復新生骨占骨缺損面積百分數(shù)隨觀察時間的延長而增加,并顯著高于同一時期對照組的所有數(shù)據(jù)(見表 1)。

表1 兩側術后各周新生骨所占面積(%,)

表1 兩側術后各周新生骨所占面積(%,)

組 別 第 2周 第 4周 第 8周 第12周實驗組 19.58± 7.651) 50.15± 12.692) 84.44± 9.772) 96.50± 7.052)對照組 10.98± 5.35 19.66± 10.15 42.94± 12.92 54.97± 7.65注:與同一期對照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.001。

3 討 論

骨缺損的修復一直是骨科研究領域的難題,1998年Marx首次將 PRP復合自體骨移植修復下頜骨缺損,顯示了良好的成骨效應。此后有大量應用不同載體復合 PRP修復骨缺損的實驗報道,從影像學、組織學與組織形態(tài)學上也證實了 PRP能明顯促進骨缺損的修復[3,5,6]。也有部分實驗報道認為 ,只有當 PRP與自體骨混合植入,才能表現(xiàn)出對骨缺損修復的促進作用,而單純和異體骨或人工骨混合使用,未能表現(xiàn)出對于骨缺損修復的促進作用。Choi[7]的實驗表明,PRP并不能促進自體骨移植后頜骨缺損的修復。本實驗的目的是為了探討 PRP與人工骨復合,在同一個體上是否具有促進骨缺損修復作用。

從自體全血中提取的 PRP,制作簡單 ,無免疫原性 ,且含有多種有利于骨愈合的生長因子如 TGF-β、PDGF和類胰島素生長因子等。骨形成過程中,既與單一骨生長因子的分泌和表達水平有關,同時又受到因子間復雜的網(wǎng)絡調節(jié),PRP中各種生長因子間濃度比例最接近正常比例,提供的就是一種與體內生長因子修復系統(tǒng)相似而濃度更高的生長因子網(wǎng)絡系統(tǒng)。各種生長因子間能發(fā)揮最佳協(xié)調作用,從而促進移植骨的生長。國內外研究者也證實添加多種生長因子比用單一生長因子更有利于促進骨愈合。

PRP促進骨愈合是由于其內所含的血小板能釋放多種高濃度生長因子。生長因子是一系列有絲分裂原因子的傳遞工具,可增強未分化間充質細胞增殖和血管形成,對移植物的血管化起著重要作用,在骨修復的早期尤為關鍵。在骨折的自然愈合過程中,骨折端血凝塊中的纖維蛋白和血小板聚集并釋放各種生長因子,對骨折的愈合起主導作用。但有研究發(fā)現(xiàn),血小板在傷口內的壽命和生長因子直接效應不超過5 d。 Marx等[8]認為一次性植入的血小板凋亡以后,巨噬細胞將替代血小板,成為生長因子的主要來源。但在本實驗中,術后第 2周時實驗組并未有大量的巨噬細胞的出現(xiàn)。

有研究表明 PRP與固體材料β-磷酸三鈣 (β-tricalcium phosphate,β-TCP)、同種異體骨、自體骨等復合后,在骨再生的各個不同階段,通過直接或間接的作用,促進細胞的增殖與分化[9～11],從而促進新骨再生。由于 PRP自身沒有強度,而且還需要凝血酶、鈣離子激活才能發(fā)揮生物效應,限制了它的應用[12]。本實驗利用 PRP中含有多種生長因子的特性,與羥基磷灰石生物陶瓷結合后 ,提供抗壓強度、骨傳導性,用于修復兔橈骨骨缺損。實驗結果表明,從大體標本、組織學,X線片及射透電鏡觀察,術后早期 2周時實驗組和對照組并無明顯差異。隨著觀察時間的延長,實驗側新骨生長速度和數(shù)量明顯優(yōu)于對照側,顯示了 PRP良好的促成骨效應。

由于本實驗樣本量較少,且僅對 PRP對成骨的影響進行研究,對 PRP與不同材料結合后成骨的生物力學方面影響尚待進一步研究。

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