蔣 迪 ，劉 飛 ，黃秋林 *

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng)420001；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

芹菜素是一種廣泛存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物，與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切?，F(xiàn)有研究證實(shí)芹菜素能抑制多種腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡，主要包括：胃癌[1]、肝癌[2]、卵巢癌[3]和宮頸癌[4]。本文旨在對(duì)比研究芹菜素對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞和永生化人胃粘膜上皮GES-1細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 芹菜素(apigenin,API)由美國(guó)Sigma公司出品；CellTiter 96 AQueoous細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒由普洛麥格公司(中國(guó)北京)生產(chǎn)；碘化丙啶（PI）由美國(guó)英杰生物技術(shù)公司出品；Caspase 3 Activity Detection Kit由美國(guó)Millipore公司出品。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌BGC-823細(xì)胞系細(xì)胞來自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞中心；永生化人胃粘膜GES-1細(xì)胞系細(xì)胞來自北京市腫瘤研究所。用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.3 MTS比色法測(cè)定 按照CellTiter 96 AQueoous細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒操作說明書的步驟完成，用EXL-800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。

1.4 PI染色FCM分析 參照文獻(xiàn)[5]描述的方法操作。用EPICS XL流式細(xì)胞儀(美國(guó)COULTER公司)測(cè)定10000個(gè)細(xì)胞的DNA含量，SYSTEM II軟件分析Sub-G1細(xì)胞百分率。

1.5 Caspase-3活性檢測(cè) 參照Caspase 3 Activity Detection Kit(美國(guó)Millipore公司)說明書描述的步驟操作，用EXL-800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以405nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。如果方差具有齊性，用LSD法進(jìn)行多樣本均數(shù)之間的兩兩比較；如果方差不齊，采用Tuker HSD進(jìn)行多樣本均數(shù)之間的兩兩比較。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素抑制BGC-823細(xì)胞和GES-1細(xì)胞活力作用比較

圖1顯示，芹菜素對(duì)BGC-823細(xì)胞活力有顯著抑制作用(P＜0.01)，呈濃度依賴性，其 IC50是22 μmol/L；然而，對(duì)GES-1細(xì)胞活力抑制作用弱，其IC50 達(dá)到 77 μmol/L；選擇指數(shù)是 3.5(77/22)。

2.2 芹菜素誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞和GES-1細(xì)胞DNA降解作用比較

圖1 芹菜素選擇性抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞活力

圖2 API選擇性誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞DNA降解

圖2可見，API以濃度依賴方式誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞Sub G1百分率增高(P＜0.01);但是，其對(duì)GES-1細(xì)胞作用微弱。說明：API選擇性誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞的基因DNA降解。

PI染色FCM分析Sub G1細(xì)胞百分率。數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的mean±SD，與相同濃度API處理GES-1細(xì)胞比較,**P＜0.01；與相同濃度API處理GES-1細(xì)胞比較，***P＜0.001。

2.3 芹菜素對(duì)BGC-823細(xì)胞和GES-1細(xì)胞Caspase-3活化作用的比較

ELISA法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞和GES-1細(xì)胞Caspase-3活性。結(jié)果表明，API選擇性激活BGC-823 細(xì)胞 Caspase-3(P＜0.01)。

圖3 API選擇性活化BGC-823細(xì)胞Caspase-3

3 討論

已有研究表明，API在體外可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡;Chiang等[4]研究發(fā)現(xiàn)在Hep G2,Hep3B和PLC/PRF/5這3種肝癌細(xì)胞系中,API可顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),但在鼠源正常肝細(xì)胞系BNLCL.2細(xì)胞中,無此效應(yīng)。在Hep G2肝癌細(xì)胞中芹菜素的效力和抗肝癌藥52氟尿嘧啶(52Fu)的效力相似。本文首先對(duì)照研究API抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞和永生化胃粘膜上皮GES-1細(xì)胞活性的差異，探討其是否對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞活性具有選擇性抑制作用。正如我們預(yù)期的那樣，本文MTS比色測(cè)定的結(jié)果證實(shí)，API對(duì)BGC-823細(xì)胞活性抑制作用的選擇指數(shù)為3.5(圖1)；具有選擇性殺傷癌細(xì)胞的藥效學(xué)特性。

其次，本文還試圖探索API選擇性抑制BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)是否通過選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。本文的PI染色FCM分析結(jié)果表明，API以濃度依賴方式誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞Sub G1百分率增高(P＜0.01);但是，其對(duì)GES-1細(xì)胞作用微弱 (圖2)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)API選擇性激活BGC-823細(xì)胞Caspase-3(圖3)。這些結(jié)果提示，API具有選擇性誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡作用，而該作用可能是其選擇性抑制細(xì)胞活性的主要原因。

總之，我們證實(shí)，無基因毒性的黃酮API具有選擇性抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用；具有作為人胃癌預(yù)防和治療劑的潛在價(jià)值。

[1]胡太平,曹建國(guó).芹菜素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制研究[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2007,27(10):6-10.

[2]Chiang LC,Nglt T,Lini C,et al.Anti-proliferative effect of apigenin and its apoptotic induction in human Hep G2 cells[J].Cancer Lett,2006,237(2):207-214.

[3]杜俊瑤,辛彥.芹菜素抑制人卵巢癌CAOV3細(xì)胞增殖的研究[J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2007,23(5):374-375.

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[5]王莉,向紅琳,曹建國(guó),等.染料木黃銅衍生物抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷的活性篩選[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,6(3):12-15.