戚桂娜 ，張波 ，王彥杰 ，荊瑞勇 ，高亞梅 ，王偉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)工程學(xué)院）

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，規(guī)模化畜禽飼養(yǎng)的比例不斷擴(kuò)大，大量的沒有處理的畜禽糞尿?qū)Νh(huán)境造成了嚴(yán)重污染，為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就畜禽養(yǎng)殖對(duì)環(huán)境污染的影響進(jìn)行了廣泛深入的研究[1-6]。采用厭氧消化技術(shù)處理畜禽糞便等廢棄物，不僅可以減少畜禽糞便對(duì)環(huán)境造成的污染，同時(shí)還產(chǎn)生清潔的生物質(zhì)能源沼氣，為固體廢棄物的可再生利用提供了廣泛的應(yīng)用前景。

厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣的過程是由多種微生物相互作用共同來完成的，產(chǎn)甲烷菌群和非產(chǎn)甲烷菌群間通過互營(yíng)聯(lián)合生成甲烷[7，8]，因此，沼氣發(fā)酵微生物的研究一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。對(duì)于沼氣發(fā)酵微生物的研究國(guó)內(nèi)外學(xué)者都進(jìn)行了廣泛的研究，孫征等、Simankova等、Ma等以及Kendall等從不同的環(huán)境中分別分離得到了若干不同的產(chǎn)甲烷古菌[9-12]。人們逐漸意識(shí)到發(fā)酵菌種在沼氣發(fā)酵過程中扮演的重要角色，因此，越來越多的研究者對(duì)于厭氧發(fā)酵菌種馴化開展了深入的研究，希望通過馴化培養(yǎng)獲得高產(chǎn)氣效率的沼氣發(fā)酵微生物系統(tǒng)。張翔等研究了在高溫條件以生活污水處理廠的不同種類污泥作為接種物對(duì)厭氧發(fā)酵各參數(shù)的影響，結(jié)果表明以馴化后的污泥為接種物，可以加快厭氧啟動(dòng)速度，提高產(chǎn)氣量[13]。陸清忠等利用馴化的低溫菌群為接種物，加入沼氣池內(nèi)增加池內(nèi)微生物菌群的數(shù)量來提高產(chǎn)期率，結(jié)果比對(duì)照日平均產(chǎn)氣量和總產(chǎn)氣量增長(zhǎng)率達(dá)158.97%和159.03%[14]。眾多研究結(jié)果表明，在畜禽糞便厭氧發(fā)酵初始階段加入一定量的接種物，對(duì)提早產(chǎn)氣和提高產(chǎn)氣量有重要的作用[15-17]。但是，以往的關(guān)于沼氣發(fā)酵接種物的研究，都是直接把沼液或者通過一定的馴化方式馴化的沼液作為接種物作為研究對(duì)象，接種物的微生物組成不清楚，接種物不能穩(wěn)定遺傳，無法作為恒定的研究對(duì)象進(jìn)行機(jī)理性研究。如果能夠得到遺傳穩(wěn)定、高效產(chǎn)甲烷的復(fù)合菌系，既可以解決上述理論研究問題，又可以用于沼氣的生產(chǎn)實(shí)踐。本文就是按照上述思路，在實(shí)驗(yàn)室條件下利用限制性培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建了1組35℃條件下遺傳穩(wěn)定的、產(chǎn)甲烷量高的沼氣發(fā)酵復(fù)合菌系并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，以期獲得該復(fù)合菌系最適宜的發(fā)酵條件，達(dá)到產(chǎn)氣速度快、產(chǎn)氣量高的目的，為厭氧發(fā)酵的生產(chǎn)實(shí)踐提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

本試驗(yàn)所用的沼氣發(fā)酵復(fù)合菌系裝置和集氣裝置由兩部分組成，如圖1所示。反應(yīng)器置于35℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫控制，選用250 mL培養(yǎng)瓶作為發(fā)酵裝置，瓶口用適當(dāng)大小的不透氣橡皮塞塞緊，在橡皮塞的中央用點(diǎn)滴管導(dǎo)氣連接到一個(gè)量筒中，將集氣量筒倒扣于盛滿水的容器內(nèi)，采用排水集氣法收集氣體。

圖1 沼氣復(fù)合菌系培養(yǎng)裝置Fig.1 The cultural device of microbial community of biogas production

1.2 試驗(yàn)材料

沼氣發(fā)酵復(fù)合菌系，由本實(shí)驗(yàn)室利用限制性培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過多代的培養(yǎng)獲得，牛糞，厭氧菌培養(yǎng)基，真空泵，集氣量筒等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沼氣發(fā)酵復(fù)合菌系的構(gòu)建

將取自黑龍江省大慶市林甸縣沼氣池中的池液作為供菌種樣品，以10%的接種量接種到裝有100 mL無氧富集培養(yǎng)基的沼氣發(fā)酵裝置中，密封，用真空泵抽真空后將純度為99.999%氮?dú)獬淙肱囵B(yǎng)瓶中，反復(fù)抽真空和充入氮?dú)?，直至加入指示劑樹脂刃天青的發(fā)酵培養(yǎng)基變?yōu)闊o色為止，連接集氣裝置，35℃靜置培養(yǎng)。當(dāng)日產(chǎn)氣量呈下降趨勢(shì)后，取10 mL培養(yǎng)液作為種子接到同樣的新鮮培養(yǎng)基中。如此一直繼代培養(yǎng)，淘汰產(chǎn)氣時(shí)間晚、總產(chǎn)氣量低的培養(yǎng)物，留下產(chǎn)氣時(shí)間早、總產(chǎn)氣量高的培養(yǎng)物。經(jīng)幾十代以上連續(xù)繼代培養(yǎng)，選擇高效穩(wěn)定的培養(yǎng)物，進(jìn)行保存。

1.3.2 發(fā)酵液初始pH對(duì)沼氣復(fù)合菌系產(chǎn)氣能力的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì) 5個(gè)pH值因素分別為：6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，總固體濃度（TS%）為8%，接種量為10%進(jìn)行試驗(yàn)，用甲烷產(chǎn)率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 接種量對(duì)沼氣復(fù)合菌系產(chǎn)氣能力的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)接種量因素分別為：5%、10%和15%，TS%為8%，pH7.0進(jìn)行試驗(yàn)，用甲烷產(chǎn)率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 底物濃度(TS%)對(duì)沼氣復(fù)合菌系產(chǎn)氣量能力的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)發(fā)酵液濃度因素分別為：6%、8%、10%和12%，接種量為10%，pH7.0進(jìn)行試驗(yàn)，用甲烷產(chǎn)率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化組合試驗(yàn)

分別以初始pH、底物濃度（TS%）和接種量為因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交組合進(jìn)行試驗(yàn)，研究各因素組合對(duì)沼氣發(fā)酵的影響，用甲烷產(chǎn)率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，因素水平表如表1。因?yàn)樵囼?yàn)是3因素3水平的試驗(yàn)，選取L9（33）即可滿足要求，根據(jù)正交表L9（33）安排試驗(yàn)。

表1 因素水平表Table 1 Different level values of the factors

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 日產(chǎn)氣量測(cè)定

采用排水集氣法。

1.4.2 甲烷含量的測(cè)定

測(cè)定儀器為島津GC-17A型氣相色譜儀，火焰光度檢測(cè)器（FID），毛細(xì)柱（DB-1）0.53 mm×15 m。柱溫：100℃；進(jìn)樣口溫度：110℃；檢測(cè)器溫度：200℃；載氣流速：20 mL·min-1；氫氣壓力：50 kpa；空氣壓力：55 kpa。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼氣發(fā)酵復(fù)合菌系的獲得

按照1.3.1的試驗(yàn)方法，以甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)氣時(shí)間作為衡量指標(biāo)，連續(xù)富集培養(yǎng)。逐漸淘汰產(chǎn)氣率低、產(chǎn)氣慢的組合，留下產(chǎn)氣量高、產(chǎn)氣快的組合。經(jīng)過20代以上的繼代培養(yǎng)，復(fù)合菌系的產(chǎn)甲烷能力與產(chǎn)甲烷時(shí)間逐漸穩(wěn)定。選取其中一組產(chǎn)氣時(shí)間早、產(chǎn)氣量穩(wěn)定的沼氣復(fù)合菌系進(jìn)行連續(xù)5代的富集培養(yǎng)，進(jìn)行日產(chǎn)氣率分析。圖2為傳代至第22代至26代沼氣復(fù)合菌系后發(fā)酵液的日產(chǎn)氣率的變化，從圖中可見，日產(chǎn)氣率逐漸穩(wěn)定，最高產(chǎn)氣率可達(dá)1.6 m3·m-3·d-1。

圖2 連續(xù)富集培養(yǎng)五代的沼氣復(fù)合菌系的日產(chǎn)氣率的變化Fig.2 Change of daily biogas yield at five different generation of microbial community

2.2 初始pH值對(duì)復(fù)合菌系產(chǎn)氣能力的影響

不同初始pH值對(duì)沼氣復(fù)合菌系沼氣發(fā)酵的甲烷產(chǎn)率的動(dòng)態(tài)變化見圖3。沼氣發(fā)酵進(jìn)行到第3 d各處理出現(xiàn)甲烷產(chǎn)率高峰，甲烷產(chǎn)量最高的處理為初始 pH 值為 7.0 的處理，為 0.57 m3·m-3·d-1，其次為初始pH值為6.5的處理。隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，甲烷產(chǎn)率逐漸降低，培養(yǎng)9 d后，各處理甲烷產(chǎn)率趨于平穩(wěn)。由此表明，初始pH值為6.5～7.5是沼氣復(fù)合菌系適宜的培養(yǎng)條件。

圖3 初始pH值對(duì)接種沼氣復(fù)合菌系甲烷產(chǎn)率的影響Fig.3 The effect of different initial pH of microbial community of biogas production on methane yield

2.3 接種量對(duì)復(fù)合菌系產(chǎn)氣能力的影響

不同接種量接種對(duì)沼氣復(fù)合系甲烷產(chǎn)率動(dòng)態(tài)變化的影響見圖4。沼氣發(fā)酵第9 d，各處理出現(xiàn)甲烷產(chǎn)率高峰，最高處理為15%接種量處理，為0.49 m3·m-3·d-1，其次為接種量為5%的處理。但接種量為10%的處理，甲烷產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在第5 d，其甲烷產(chǎn)率為0.45 m3·m-3·d-1。隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，甲烷產(chǎn)率逐漸降低，培養(yǎng)13 d后，各處理甲烷產(chǎn)率趨于平穩(wěn)。由此表明，與其他處理相比，接種量為10%的處理產(chǎn)甲烷高峰可提前4 d?？紤]成本及產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)時(shí)間，本研究采用10%為最適接種量。

圖4 接種量對(duì)沼氣復(fù)合菌系甲烷產(chǎn)率的影響Fig.4 The effect of inoculation quantities of microbial community of biogas production on methane yield

2.4 底物濃度（TS%）對(duì)復(fù)合菌系產(chǎn)氣能力的影響

不同底物濃度對(duì)沼氣復(fù)合菌系甲烷產(chǎn)率的動(dòng)態(tài)變化影響如圖5。沼氣發(fā)酵第7 d，各處理出現(xiàn)甲烷產(chǎn)率高峰，最高處理為底物濃度為8%的處理，甲烷產(chǎn)率為 0.56 m3·m-3·d-1，其次為底物濃度為 10%的處理。隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，甲烷產(chǎn)率逐漸降低，培養(yǎng)20 d后，各處理甲烷產(chǎn)率趨于平穩(wěn)。由此表明，固形物含量為8%的處理在產(chǎn)甲烷高峰時(shí)，可提高甲烷產(chǎn)率。

圖5 底物濃度對(duì)沼氣復(fù)合菌系甲烷產(chǎn)率的影響Fig.5 The effect of substrate concentrations of microbial community of biogas production on methane yield

2.5 正交組合試驗(yàn)結(jié)果分析

以初始pH、底物濃度（TS%）和接種量為試驗(yàn)因素，產(chǎn)氣量和產(chǎn)甲烷產(chǎn)量為測(cè)定指標(biāo)設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。在9組試驗(yàn)中產(chǎn)氣量最高的為第 9 組，產(chǎn)氣量可達(dá)到 0.52 m3·m-3·d-1，甲烷含量達(dá)到 0.40 m3·m-3·d-1。其次是第 3 組試驗(yàn)，最高產(chǎn)氣量為 0.48 m3·m-3·d-1，甲烷含量為 0.34 m3·m-3·d-1。通過SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Orthogonal test analysis and results of the experiments

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

由表3的方差分析結(jié)果可知，試驗(yàn)各因素均未達(dá)到顯著水平，可能是由于所選因素不夠全面，在此梯度范圍內(nèi)差異不夠明顯。但是，從產(chǎn)氣量和甲烷含量分析可知：B因素（底物濃度）F值最大，其次是因素A（接種量），影響最小的為C因素（pH）。說明，在整個(gè)發(fā)酵過程中發(fā)酵液底物的總固體濃度在發(fā)酵過程中對(duì)產(chǎn)氣量的影響最大，接種量對(duì)發(fā)酵的影響不大，接入接種物一般是為了加大發(fā)酵體系的微生物量，加快發(fā)酵啟動(dòng)的時(shí)間和縮短發(fā)酵周期的目的。C因素在整個(gè)發(fā)酵過程中的影響不顯著且作用最小，說明整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)對(duì)pH的緩沖能力比較強(qiáng)，在較寬泛的范圍內(nèi)都能進(jìn)行正常的沼氣發(fā)酵。

所以，通過本實(shí)驗(yàn)可以得出在后續(xù)的發(fā)酵過程中為了盡量提高底物濃度，一般選取5%為接種量，10%的底物濃度，pH一般自然狀態(tài)就可以。這樣不但可以增加產(chǎn)量，同時(shí)也可以提高甲烷的含量。

3 討論與結(jié)論

隨著對(duì)禽畜糞便厭氧發(fā)酵中微生物菌群功能的逐漸認(rèn)識(shí)，人們逐漸意識(shí)到了純培養(yǎng)的局限性，一些研究者已經(jīng)開始利用各種方法研究利用多次馴化培養(yǎng)的培養(yǎng)物為接種物來進(jìn)行沼氣發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)[18-20]，但是在人工可控條件下具有遺傳穩(wěn)定和產(chǎn)氣能力穩(wěn)定的產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的中溫35℃條件下產(chǎn)氣和遺傳穩(wěn)定的沼氣發(fā)酵復(fù)合菌系，產(chǎn)氣率與其他研究報(bào)道相比相對(duì)低[21-23]，分析其原因可能如下：首先，整個(gè)發(fā)酵過程沒有進(jìn)行攪拌，同時(shí)是分批試驗(yàn)，不是連續(xù)進(jìn)出料試驗(yàn)，造成產(chǎn)氣率較低。其次，發(fā)酵原料為牛糞，牛糞本身的產(chǎn)氣率較低。第三，發(fā)酵容器體積小，可能影響產(chǎn)氣率。針對(duì)以上分析，今后試驗(yàn)將進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)。

本試驗(yàn)以牛糞為發(fā)酵基質(zhì)，在設(shè)計(jì)的三個(gè)單因素試驗(yàn)中，pH6.0～8.0中以初始pH值為7.0的處理與其他組相比效果最好，這和Herbert、劉德江等的試驗(yàn)pH值在6～8范圍內(nèi)均可發(fā)酵、但是pH調(diào)到7.5左右發(fā)酵最佳的報(bào)道相符[24，25]。接種量的試驗(yàn)中接種量為10%的處理產(chǎn)甲烷高峰可提前4 d，與15%接種量相比提前達(dá)到產(chǎn)甲烷的高峰期，綜合考慮成本及產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)時(shí)間等因素，10%可作為適宜的接種量。在底物濃度的實(shí)驗(yàn)中，底物濃度為8%時(shí)甲烷含量最高。在夏季氣溫較高條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到10%、12%時(shí)，發(fā)酵液濃度過高造成了發(fā)酵液的pH變化過大，進(jìn)而影響了微生物的生長(zhǎng)，所以產(chǎn)甲烷量就受到了明顯的影響，這與夏國(guó)俊的研究，沼氣池在夏季最佳物料濃度為6%～10%相符[26]。這說明采用不同的發(fā)酵工藝形式，發(fā)酵料液的濃度對(duì)產(chǎn)氣效果的影響是不同的。通過單因素和L9（33）正交實(shí)驗(yàn)分析，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行修正后確定該沼氣復(fù)合菌系的最佳發(fā)酵條件為：接種量5%，底物濃度10%，pH自然狀態(tài)，培養(yǎng)溫度35℃。

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