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鴨多殺性巴氏桿菌外膜蛋白A基因表達及抗原性鑒定

2010-07-04 05:44郭東春劉家森姜騫司昌德林歡韓凌霞崔玉東曲連東
關鍵詞:殺性信號肽膜蛋白

孫? ,郭東春 ,劉家森 ,姜騫 ,司昌德 ,林歡 ,韓凌霞 ,崔玉東 ,曲連東

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,大慶 163319;2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室實驗動物研究室)

鴨巴氏桿菌病又叫鴨出血性敗血癥或鴨霍亂,是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一種急性、敗血性傳染病。多種禽類都可感染,但以鴨、雞、鵝最易感[1]。雛鴨的發(fā)病率和死亡率較高。本菌革蘭氏染色為陰性,主要以其莢膜抗原和菌體抗原區(qū)分血清型,前者有5種,后者分為16個型[2]。到目前為止,分離的禽多殺性巴氏桿菌血清型主要是1:A、3:A和5:A,我國分離到的鴨多殺性巴氏桿菌以 5:A 為最多,其次為 8:A[3,4]。該菌正常存在于多種健康鴨口腔和咽喉部粘膜,當機體處于應激狀態(tài),抵抗力低下時,細菌侵入體內(nèi),大量繁殖并致病,發(fā)生內(nèi)源性傳染[2]。本菌廣泛分布于世界各地,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,被列為重點防治的疫病之一。

外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)是革蘭氏陰性菌細胞壁的特有成分,鑲嵌于細胞膜的中間,在維持外膜結構、物質(zhì)轉運,以及細菌對宿主的感染和致病過程等方面,起著重要的作用[5]。Omp A蛋白是外膜蛋白中的的一種重要的蛋白,這種蛋白是相對保守的,作為跨膜蛋白與宿主細胞外基質(zhì)相互作用從而達到粘附作用[6]。Dabo報道[7],重組后的多殺性巴氏桿菌Omp A蛋白免疫小鼠能夠引起較強的TH2型免疫反應,產(chǎn)生較高的IgG抗體。

目前,關于多殺性巴氏桿菌Omp A蛋白的研究,國內(nèi)尚未見相關報道。本研究以鴨多殺性巴氏桿菌C48-102外膜蛋白A為研究對象,將去信號肽的Omp A蛋白進行克隆,實現(xiàn)了該蛋白在大腸桿菌中的表達,Western-blot結果表明,表達產(chǎn)物具有良好的抗原性,現(xiàn)具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

多殺性巴氏桿菌株C48-102購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,大腸桿菌 TOP10、BL21(DE3)、質(zhì)粒 pPROEX-Htb由本室保存。

1.2 培養(yǎng)基

BHI培養(yǎng)基購自BD公司。

1.3 酶及主要試劑

Ex-Taq聚合酶、dNTP購自寶生物工程(大連)有限公司,DNA膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司;鴨陽性血清由本室制備;HRP標記的羊抗鴨IgG購自KPL公司;其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 omp A基因的擴增和克隆

1.4.1 引物設計

按GenBank上登錄的多殺性巴氏桿菌Pm70序列(登錄號:AE004439),應用軟件設計兩對擴增的omp A基因引物:

PAF2:5’ -CGTCGAGGATCATCCAAATG-3’;PAR2:5’-GCCCGTTACAATAGCCACG-3’

pPMEA2:5’-GCGGGATCCTATGTAGGTGCTAA AGCAG-3’(下劃線為BamHI位點);

pEPMAR1:5’-CCCGTCGACTTATTTGTTACCTT TAAC-3’(下劃線為SalⅠ位點)

引物由上海invitrogen公司合成,其中,PAF2和PAR2為擴增omp A全基因;pEPMAF1和pEPMAR1為擴增omp A去信號肽的基因。

1.4.2 基因組DNA的提取

將多殺性巴氏桿菌C48-102劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基平板上,37℃恒溫過夜培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取單菌落,于 400 μL Lysis buffer(10 mmol·L-1Tris.Cl,0.5 mol·L-1NaCl,1 mmol·L-1EDTA,2%SDS) 和終濃度為 100 μg·mL-1的 Proteinase K,置 55 ℃水浴消化2 h,冷卻至室溫后用酚/氯仿/異戊醇及氯仿抽提,乙醇沉淀,最后用100 μLTE溶解DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR擴增

PCR總體積為50 μL,反應體系如下:10×Ex-Taq Buffer 5 μL,2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL,DNA 模板2 μL,上下游引物各 1 μL,Ex-Taq DNA 聚合酶0.5 μL,水36.5 μL。PCR反應條件為:94 ℃變性5 min;進入PCR循環(huán),94℃變性30 s,52退火℃ 30 s,72℃延伸90 s,共進行32個循環(huán);最后72℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物4℃保存。反應結束后,加到含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.4 克隆與鑒定

采用凝膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物的純化回收,操作方法按上海華舜生物技術有限公司凝膠回收試劑盒操作說明書進行。純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,并轉化TOP10感受態(tài)細胞,于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板,培養(yǎng)過夜。篩選陽性重組克隆,送上海invitrogen公司測序。應用DNAStar軟件對C48-102 omp A基因的測序結果與P52、PM 70、T931317、T94289 進行比對分析。

1.5 原核表達載體的構建及鑒定

將擴增去信號肽的omp A用BamH I和Sal I酶切,同時用BamH I和Sal I酶切pPRO-EX-Htb質(zhì)粒,用DNA膠回收試劑盒將酶切的擴增去信號肽的omp A和pPRO-EX-Htb回收,操作方法按試劑盒操作說明書進行?;厥蘸蟮膒PRO-EX-Htb載體與omp A基因片段連接,將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌TOP10,挑取轉化子,小提質(zhì)粒,用BamH I和Sal I酶切鑒定,正確的重組質(zhì)粒Htb-omp A送上海invitrogen公司測序。

1.6 omp A基因的表達及SDS-PAGE分析

取測序正確的重組質(zhì)粒Htb-omp A轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞,挑取單個菌落,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值 0.4~0.6,加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol·L-1,誘導表達5 h,同時設空白載體對照。用12%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳。

1.7 Western-blot分析

按常規(guī)方法轉膜,轉移后的NC膜在5%脫脂乳中封閉過夜,將膜浸入1∶50用5%脫脂乳稀釋的鴨抗多殺性巴氏桿菌陽性血清,37℃孵育1 h,用PBS洗滌3次,每次10 min,再加入到1∶2500倍稀釋的HRP標記的羊抗鴨IgG中,37℃孵育1 h,用PBS洗滌4次,以二氨基聯(lián)苯氨(DAB)為底物顯色,觀察結果。

2 結果

2.1 omp A基因的擴增與克隆

利用引物PAF2和PAR2成功擴增了ompA全基因片段,擴增片段大小為1062 bp(見圖1)。利用截斷信號肽引物pPMEA2和pEPMAR1擴增片段大小為975 bp,編碼324個氨基酸(具體結果略)。

圖1 Omp A全基因的PCR擴增Fig.1 PCR ampification of omp A gene

2.2 omp A的序列分析

C48-102 與 GenBank 中 P52、PM 70、T931317、T94289等多種血清型多殺性巴氏桿菌的omp A基因序列比對結果表明:在核苷酸水平上同源性為89.0%~98.9%;在氨基酸水平上同源性為90.7%~99.2%。

通過生物學軟件比對Omp A氨基序列發(fā)現(xiàn),C48-102株Omp A蛋白全長為1062個氨基酸,C48-102株Omp A氨基酸序列只與B型多殺性巴氏桿菌P52存在部分的缺失,即63-64位、151-153位。

2.3 原核表達重組質(zhì)粒的構建

利用引物pEPMAF1和pEPMAFR1擴增的去信號肽的omp A基因與pPRO-EX-Htb構建的重組質(zhì)粒Htb-omp A,用BamH I和SalⅠ雙酶切得到約1000 bp目的條帶,鑒定結果見圖2。同時,將重組質(zhì)粒Htb-omp A送上海invitrogen公司進行測序,與原測序結果一致。

2.4 omp A基因的原核表達及Western-blot檢測

將重組質(zhì)粒Htb-omp A轉化BL21,用IPTG誘導后進行SDS-PAGE電泳,在大約35 kDa處有一條明顯的表達帶,與預期的分子量大小相符合(圖3A)。Western-blot的結果表明,表達的蛋白具有較好的抗原性(圖3B)。

圖3 Omp A表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot檢測結果Fig.3 SDS-PAGE and Western-blot analysis of the recombinant protein Omp A

3 討論

本研究采用PCR技術成功擴增了鴨多殺性巴氏桿菌C48-102株omp A基因,整個ORF為1062 bp,編碼354個氨基酸,利用生物學軟件對omp A基因序列進行同源性分析發(fā)現(xiàn),C48-102菌株與其余已發(fā)表的不同血清型的多殺性巴氏桿菌P52、PM 70、T931317、T94289的序列比對結果表明:omp A基因在核苷酸水平上同源性為89.0%~98.9%;在氨基酸水平上同源性為90.7%~99.2%;C48-102株Omp A氨基酸序列只與B型多殺性巴氏桿菌P52株存在部分的缺失,血清B型P52株omp A全長1077 bp,比PM70和C48-102都長15 bp,多編碼4個氨基酸,鑒于GenBank中多殺性巴氏桿菌的omp A的序列有限,這與多殺性巴氏桿菌的血清型和毒力的相關性有待于進一步研究。

近年來,外膜蛋白對細菌致病機理和免疫性作用機理的研究取得了很大的進展,這將有助于解釋外膜蛋白誘發(fā)保護性反應的機理,以及外膜蛋白在誘發(fā)免疫應答時與免疫細胞的相互作用。Omp A蛋白為跨膜蛋白,有研究表明,該蛋白除了具有維持外膜結構的作用外,其主要作用是在細菌感染早期與細胞基質(zhì)相互作用,定植于宿主細胞[7]。外膜蛋白A序列具有很高的保守性,良好的免疫原性,可刺激體液免疫和細胞免疫[8]。據(jù)報道,重組的Omp A蛋白能夠引起強烈的Th2類型的免疫反應,具有較高水平的IgG抗體產(chǎn)生等特點[7]。這些均表明該蛋白對禽巴氏桿菌的研究有著較深的理論基礎,為篩選多殺性巴氏桿菌omp A基因缺失株奠定基礎。

本研究所表達的成熟的Omp A蛋白是革蘭氏陰性菌外膜蛋白的一種重要成分。全基因表達產(chǎn)物由于攜帶有某些堿基干擾大腸桿菌的正常表達,這可能是由于Omp A蛋白整合到大腸桿菌外膜中,代替大腸桿菌外膜中原有的蛋白而發(fā)揮作用,從而使得大腸桿菌無法正常表達,因此截斷前90個堿基的信號肽序列后,對大腸桿菌不產(chǎn)生任何干擾作用,外膜蛋白A在大腸桿菌中表達。

利用基因技術制備重組蛋白,關鍵是獲得能夠具有活性的單一的目的蛋白。本研究選擇pPROEX-Htb表達載體,該載體含有一段編碼6個組氨酸的基因,可與重組蛋白進行高效融合表達,利用重組蛋白上組氨酸殘基能與Ni2+結合的特性,該蛋白能夠用His標簽蛋白柱式純化系統(tǒng)進行純化,這種解離蛋白很容易被層析柱吸附,因此可以得到純度較高的目的蛋白,并且所純化的目的蛋白Omp A保持了抗原活性,為敲除omp A基因多殺性巴氏桿菌突變株的血清學檢測奠定基礎。

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