江蘇省南通市中醫(yī)院外科(南通 226001)秦旭東 丁 偉 姚祖仁 陸海舟

肺癌是嚴重危害人類健康的疾病,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(W HO)2003年公布的資料顯示,肺癌無論是發(fā)病率(120萬 /年 )還是病死率(110萬 /年),均居全球癌癥首位。腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉移實質上是人體免疫功能失常所致。大量的研究證明免疫功能失調、特別是 T細胞免疫功能失常,使腫瘤細胞在發(fā)生早期能夠逃逸免疫監(jiān)控和免疫攻擊,從而發(fā)展至臨床階段。近年來,T細胞共刺激分子 B7家族有了很大的擴展。最新發(fā)現(xiàn)B7家族成員 B7-H4在體外通過抑制 T細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生,負性調節(jié) T細胞反應[1]。免疫組化分析顯示,B7-H4在正常外周組織中幾乎沒有陽性表達,而在一些卵巢癌和乳腺癌中有豐富表達[2～4]。所以,推測B7-H4具有減輕炎性反應和下調抗腫瘤免疫應答的作用。為探索一種新的診斷和治療食管癌的靶目標,本研究應用免疫組織化學染色對 B7-H4在非小細胞肺癌組織中的表達進行了研究。

資料與方法

1 臨床資料 南通市中醫(yī)院普外科于 2004年6月至 2008年 6月診治原發(fā)性非小細胞肺癌患者 80例。其中男 52例,女 28例,診斷時平均年齡 57.2歲,腺癌 38例,鱗癌 42例;13例高分化,45例中分化,22例低分化。根據(jù)手術和病理發(fā)現(xiàn)及美國聯(lián)合會癌癥分期手冊進行分期:Ⅰ期 18例,Ⅱ期 26例,Ⅲ期 34例。根據(jù) 1999年修正的最新分類法確定細胞分化程度。

2 主要試劑 兔抗人 B7-H4多克隆抗體為北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品。Vltra Sensitive S-P超敏試劑盒和 DAB顯色試劑盒為福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

3 免疫組織化學染色 采用 SP法。按照福建邁新生物技術有限公司 SP即用型試劑盒說明書進行。具體操作步驟:福爾馬林固定手術標本,石蠟包埋,切片厚度 4 μ m,二甲苯脫蠟,階梯酒精內水化。切片經(jīng)3%H2O2孵育 15min,然后置于檸檬酸鈉緩沖液(CBS,0.01mol/L,pH6)中,微波(850W)修復抗原至沸騰即止,待緩沖液自然冷卻后取出切片,依次滴加 A液(過氧化物酶阻斷劑 )孵育 15min,B液 (正常羊血清)孵育15min,兔抗人 B7-H4多克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜,C液 (生物素標記的羊抗兔 IgG)孵育 15min,D液(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液)孵育 15min,以上各步驟之間用 PBS洗,DAB顯色,蘇木素復染,常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。實驗組切片染色同時分別用 PBS、正常羊血清代替一抗,以上述步驟處理同樣切片作為空白對照和替代對照染色。

4 B7-H4的表達分析 用 SP-2000病理圖文報告系統(tǒng)進行圖像采集。通過計數(shù)在胞膜上或 P和胞漿內有陽性染色的細胞個數(shù)進行組織學分析 B7-H4的表達。在 400倍鏡下隨機選擇的 5個腫瘤區(qū)域進行細胞計數(shù)。 B7-H4的染色強度根據(jù)陽性細胞的百分比進行半定量分級:0: ＜ 10%;(+):10%～40%;(?):40%～80%;(?):＞ 80%。結果判斷:＜10%為陰性;10%～100%為陽性。

5 統(tǒng)計學處理 用 SPSS12進行數(shù)據(jù)分析。進行i2檢驗和 Fisher精確檢驗分析 B7-H4的表達及其與各臨床參數(shù)之間的關系。以P ＜0.05為有顯著性差異,P ＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 B7-H4在非小細胞肺癌組織中的表達 非小細胞肺癌組織中 B7-H4呈彌漫性表達,在胞漿和胞膜均有表達(見圖 1),80例非小細胞肺癌組織中,B7-H4表達的陽性率為 37.5%(30/80)。陽性者表達強度大部分在 (? )以上 (見圖 1)。

2 在非小細胞肺癌中 B7-H4的表達及其與病理特征的關系 見附表。鱗癌和腺癌患者 B7-H4陽性表達率間無顯著性差異(P＞ 0.05);不同年齡、性別、吸煙史或分化程度患者 B7-H4陽性表達率間均無顯著性差異(P＞0.05);發(fā)生淋巴結轉移和未發(fā)生淋巴結轉移患者 B7-H4的陽性表達率間有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 免疫組織化學染色(SP×100)非小細胞肺癌組織B7-H4陽性表達(?)

圖2 免疫組織化學染色(SP×100)非小細胞肺癌組織B7-H4陰性表達

討 論

肺癌是嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤,治療方面目前主張以手術為主的多學科綜合治療,尚無更確切有效的治療方法,而且影響預后的因素不甚明確。非小細胞肺癌是肺癌常見的類型,預后較差,肺癌化學治療雖能降低癌癥病死率,但現(xiàn)有的抗腫瘤藥具有殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞也有較大的殺傷性副作用,同時易出現(xiàn)耐藥。免疫治療是近年來科學工作者廣泛認同的較為理想的腫瘤治療方法,其療效提高的關鍵有賴于對腫瘤局部免疫微環(huán)境的深入了解。大量的分子生物學研究證實,免疫功能失調,特別是 T細胞免疫功能失常,使腫瘤細胞在發(fā)生早期能夠逃逸免疫監(jiān)控和免疫攻擊,進而發(fā)展至臨床階段。尋找有價值的分子標志物或者非小細胞肺癌相關基因將有助于揭示非小細胞肺癌發(fā)生與發(fā)展的分子機制。

附表 不同臨床病理因素影響下 B7-H4的表達情況

20世紀 80年代以來,人們認識到 T淋巴細胞的活化需涉及多種細胞間大分子物質的相互作用。隨著T細胞活化信號傳導途徑研究的不斷深入,與 B7分子有關的共刺激通路及抑制通路在感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥反應中的作用越來越受到人們的關注[7]。

B7-H4(又稱 B7s1和 B7x)是 B7家族中的最新發(fā)現(xiàn)的一個新成員[5～7],它能通過抑制 T細胞的增殖、細胞因子的產(chǎn)生和細胞周期的進程來負性調控 T細胞的免疫應答。

2003年,Chen等[5～7]三個實驗室利用生物信息學的方法相繼發(fā)現(xiàn)了 B7-H4分子。 B7-H4表達在專職APC和廣泛分布在非淋巴組織上[5]。Northern Blot分析示 h B7-H4mRNA在脾、肺和胸腺組織表達豐富。有RT-PCR顯示,在所有鼠組織中均檢測到 m RNA[5]。在某些腫瘤組織(如卵巢癌、乳腺癌、子宮腫瘤和肺癌等)中發(fā)現(xiàn) B7-H4的組成性高表達[2～4,8～14]。在腫瘤相關巨噬細胞上表達的 B7-H4可以抑制抗腫瘤免疫反應。大部分的人類腫瘤的肺癌[15],卵巢癌[13],乳腺癌[16]細胞表面表達 B7-H4。

Zhang等[6]證實細胞表面表達的 B7-H4可以抑制T細胞反應。此外前期研究工作還發(fā)現(xiàn),B7-H4的調控作用能使 T細胞的細胞周期停滯在 G0/G1期[5],體內輸入 B7-H4Ig抑制同種反應性 CTL活性。 B7-H4Ig在體內能抑制 CD8+ CTL的增殖和成熟[5]。內源性 B7-H4可以抑制同種性 CT L的產(chǎn)生,支持內源性 B7-H4在抑制細胞介導的免疫反應中的作用[5]。另外李文樺實驗證實[17],如果將不表達或低表達 B7-H4mRNA的腫瘤細胞株接種小鼠,形成的腫瘤組織不僅高表達其mRNA,而且高表達 B7-H4蛋白分子。

Sica等人發(fā)現(xiàn) B7-H4抑制了 T細胞反應。B7-H4Ig也明顯抑制了 IL-2和 IL-10的產(chǎn)生。 B7-H4Ig能抑制B7-1共刺激的 T細胞分泌 IL-2、4、10和 IFN-γ。 結果顯示 B7-H4誘導的 T細胞增殖抑制不能被 CD28共刺激所逆轉[7]。 Kryczek等在研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中IL-6、IL-10含量的升高,刺激了巨噬細胞 B7-H4的表達,與之相對應,CSF、IL-4抑制了巨噬細胞 B7-H4的表達[18]。B7-H4的異常表達,使正常的巨噬細胞具有了抑制功能。因而 B7-H4陽性的巨噬細胞在卵巢癌中構成了一個新的抑制性細胞群。

綜上所述,非小細胞肺癌組織表達 B7-H4對機體的抗腫瘤免疫發(fā)揮抑制作用,參與免疫逃逸。由于腫瘤類型、發(fā)生部位以及腫瘤微環(huán)境中諸多因素共同影響著腫瘤細胞逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊,因而深入研究B7-H4參與腫瘤免疫逃逸的機制對腫瘤免疫治療具有十分重要的指導意義,通過干預腫瘤細胞上 B7-H4的表達,將成為腫瘤免疫治療的新靶點。

[1]Flies DB,Chen L.The new B7s:playing a pivotal role in tumor immunity.J Immunother,2007,30(3):251-260.

[2]M ugler KC,Singh M,TringlerB,et al.B7-h4 expression in a range of breast pathology:correlation with tumor T-cell infiltration. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007,15(4):363-370.

[3]Kryczek I,Wei S,Zhu G,et al.Relationship between B7-H4,regulatory T cells,and patient outcome in human ovarian carcinoma.CancerRes,2007,67(18):8900-8905.

[4]Zheng Y, Katsaros D, Shan SJ,etal. A multiparametric panelforovarian cancer diagnosis,prognosis,and response to chemotherapy.Clin Cancer Res,2007,13(23):6984-6992.

[5]Sica GL,Choi IH,Zhu G,et al.B7-H4,a molecule of the B7family,negatively regulates T cell immunity.Immunity,2003,18(6):849-861.

[6]Zang X,Loke P,Kim J,et al.B7x:a widely expressed B7family member that inhibits T cell activation.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(18):10388-10392.

[7]Prasad DV,Richards S,Mai XM,et al.B7S1,a novel B7 family member that negatively regulates T cell activation.Immunity,2003,18(6):849-861.

[8]Salceda S, Tang T, KmetM,etal. The immunomodulatoryprotein B7-H4is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation.Exp Cell Res,2005,306(1):128-141.

[9]Miyatake T,Tringler B,Liu W,et al.B7-H4(DDO-110)isoverexpressed in high risk uterine endometrioid adenocarcinomas and inversely correlated with tumor T-cell infiltration.Gynecol Oncol,2007,106(1):119-127.

[10]Simon I,Katsaros D,Rigault de la Longrais I,et al.B7-H4is over-expressed in early-stage ovarian cancer and is independent ofCA125expression. Gynecol Oncol,2007,106(2):334-341.

[11]Simon I,Liu Y,Krall KL,et al.Evaluation of the novel serum markers B7-H4,Spondin 2,and DcR3for diagnosis and early detection of ovarian cancer.Gynecol Oncol,2007,106(1):112-118.

[12]Simon I,Zhuo S,Corral L,et al.B7-H4is a novel membrane-bound protein and a candidate serum and tissue biomarker for ovarian cancer.Cancer Res,2006,66(3):1570-1575.

[13]TringlerB, Liu W, CorralL,etal. B7-H4overexpression in ovarian tumors.Gynecol Oncol,2006,100(1):44-52.

[14]Sun Y,Wang Y,Zhao J,et al.B7-H3and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer.Lung Cancer,2006,53(2):143-151.

[15]Choi IH,Zhu G,Sica GL,et al.Genomic organization and expression analysis of B7-H4,an immune inhibitory molecule of the B7family. J Immunol,2003,171(9):4650-4654.

[16]Tringler B,Zhuo S,Pilkington G,et al.B7-H4is highly expressed in ductal and lobular breast cancer.Clin Cancer Res,2005,11(1):1842-1848.

[17]李文樺,劉瑞梓,楊秀利.腫瘤模型中 B7-H4和 BTLA的異常表達.中國癌癥雜志,2005,15(4):313-316.

[18]Suh WK,Wang S,Duncan GS,et al.Generation and characterization of B7-H4/B7S1/B7x-deficient mice.Mol Cell Biol,2006,26(17):6403-6411.