西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科(西安 710061)劉 莉 王 科 趙英仁

乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,肝細(xì)胞病變主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo),T細(xì)胞激活在乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制中起了重要作用。輔助性 T細(xì)胞 17(Helper T lymphocyte 17,Th17)是新近發(fā)現(xiàn)的不同于 Th1和Th2的 CD4+T細(xì)胞亞群,以主要分泌白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)為特征[1]。 Th17細(xì)胞及 IL-17與炎性反應(yīng)及免疫相關(guān)疾病有密切關(guān)系[2],但其在病毒感染性疾病中的作用尚不完全清楚。我們擬通過(guò)對(duì) HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎及其干擾素治療過(guò)程中血清 IL-17進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)而對(duì)其作用及意義進(jìn)行評(píng)價(jià),為進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

1 一般資料 選擇 2008年5月至 2009年 3月我院門(mén)診HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者20例,其中男14例 ,女 6例 ,年齡 18～ 39歲 ,平均 26.3± 0.5歲。其診斷符合 2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[3]的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)。其 HBsAg陽(yáng)性、HBeAg陽(yáng)性病史至少6個(gè)月,3個(gè)月前血清 ALT2倍正常參考值上限(ULN),并在篩選時(shí)血清 ALT水平大于2倍且 ＜10倍 ULN,篩選時(shí)血漿 HBV DNA定量≥106U/ml。所有病例在3個(gè)月內(nèi)未經(jīng)免疫調(diào)節(jié)劑及抗病毒治療、近2個(gè)月未接受保肝治療,并排除合并其它肝炎病毒感染、酒精性肝炎等非病毒性肝炎、免疫性疾病及其他嚴(yán)重疾病。對(duì)照組11例均為同期健康體檢者,其中男7例,女4例,年齡 20～ 38歲,平均 24.3±0.6歲。兩組年齡、性別無(wú)顯著性差異,具有可比性。

2 方 法

2.1 治療及觀察方法:治療組均給予 IFN-α 1b 3MU肌注,3次 /周,療程為 24周。在治療前及治療的第4周、第8周、第12周、第18周、第24周來(lái)我院觀察癥狀、體征并檢測(cè)肝功、HBeAg定量、HBV DNA含量和血清IL-17水平。在24周治療結(jié)束時(shí),按照2009年制定的《EASL乙肝診治指南》療效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估治療效果。其病毒學(xué)應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)為治療 24周時(shí),HBV DN A水平小于2000 U/ml;血清學(xué)應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)為 HBeAg陽(yáng)性的慢性乙肝患者發(fā)生 HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

2.2 血清檢測(cè)方法:采用雙抗體夾心 ELISA法檢測(cè)血清IL-17水平,試劑為R&D公司生產(chǎn)的人 IL-17 ELISA試劑盒(敏感度＞ 15ng/L)。目錄號(hào):D1700。試劑盒編號(hào):Lot:263260。采用 ALYMPUS-AU5400全自動(dòng)生化儀檢測(cè) ALT、AST。采用 ABI Prism 7300型熒光定量 PCR檢測(cè)儀檢測(cè)血清HBV DNA水平。采用德國(guó)寶靈曼公司 Elec-sys2010電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀及羅氏公司相配套的試劑盒測(cè)定 HBeAg。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示。各組間均值比較用t檢驗(yàn),所有的檢驗(yàn)都是雙側(cè)的,P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 治療組治療前血清IL-17水平分析 治療組治療前血清 IL-17平均水平為 1.64±0.89ng/L,健康對(duì)照組為 1.32±0.68ng/L。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,治療組與對(duì)照組的血清 IL-17水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 治療組各項(xiàng)指標(biāo)變化情況 治療組在治療結(jié)束時(shí)按照治療效果進(jìn)行分組。其中,應(yīng)答組 5例,無(wú)應(yīng)答組15例。應(yīng)答組HBV DNA轉(zhuǎn)陰數(shù)及HBeAg陰轉(zhuǎn)數(shù)分別為2例和3例 ,無(wú)應(yīng)答組兩者均為0例。其治療前后 ALT、 AST、 HBeAg及 HBV DNA變化情況 ,見(jiàn)表 1。

表1 治療組治療前后 ALT、AST、HBeAg及 HBV DNA變化

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,治療前兩組間 AL T、AST基線水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.184,P=0.089)。治療前后 ALT變化幅度應(yīng)答組平均值為 90.0±99.9U/L,而無(wú)應(yīng)答組平均值為5.7±70.9U/L,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療前后 AST變化幅度應(yīng)答組平均值為 62.2±32.8U/L,而無(wú)應(yīng)答組平均值為 17.5±47.0U/L,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)。

應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組 HBeAg定量基線水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。應(yīng)答組治療前與治療 24周HBeAg定量水平有差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而無(wú)應(yīng)答組治療前與治療 24周 HBeAg定量水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 治療組不同應(yīng)答情況血清 IL-17水平變化情況 ,見(jiàn)表 2。

表2 兩組患者在治療過(guò)程中血清 IL-17水平變化

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,治療前兩組間血清IL-17基線水平 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.97),治療 18周時(shí)兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.055),治療24周時(shí)兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)。

4 應(yīng)答組血清 IL-17與 HBV DNA、肝功、HBeAg,見(jiàn)圖 1～ 3。

圖1 應(yīng)答組血清 IL-17和 HBV DNA動(dòng)態(tài)變化

圖2 應(yīng)答組血清IL-17與肝功動(dòng)態(tài)變化

圖3 應(yīng)答組患者血清 IL-17與 HBeAg動(dòng)態(tài)變化

5 應(yīng)答組患者血清 IL-17變化,見(jiàn)圖 4。

圖4 應(yīng)答組患者血清 IL-17動(dòng)態(tài)變化圖

圖4結(jié)果顯示:應(yīng)答組患者血清IL-17水平在18周前無(wú)分化,而在 18周后出現(xiàn)明顯的分化,其中患者 1、2、3在 18周時(shí)漸升高,而患者 4及 5則無(wú)變化?；颊?1、2、3在治療結(jié)束時(shí),HBeAg均轉(zhuǎn)陰,而患者 4、5則未轉(zhuǎn)陰。

討 論

近期,人們通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)、膠原誘導(dǎo)的自身免疫性關(guān)節(jié)炎(CIA)兩種疾病小鼠模型進(jìn)行研究時(shí),提出存在一群獨(dú)立于 Thl、Th2的效應(yīng)性T細(xì)胞亞群-Th17細(xì)胞亞群。這群細(xì)胞由初始CD4+T細(xì)胞分化而來(lái),同傳統(tǒng) Th1和Th2細(xì)胞具有明顯不同的特征:其主要分泌 IL-17,具有表達(dá)控制其分化的獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子—孤獨(dú)受體(Orphan nuclear receptor RORγ t),不分泌 IL-4、 IFN-γ,能介導(dǎo)組織炎癥及自身免疫[4]。因此,在通過(guò)對(duì)小鼠以及人類(lèi)的大量研究后證實(shí)初始 CD4+Th細(xì)胞接受抗原刺激后可分化為至少四種類(lèi)型的 Th細(xì)胞:Thl、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg),并且這些研究結(jié)果提示 Th17細(xì)胞在人類(lèi)自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[5]。與 Thl主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)病原微生物感染和 Th2調(diào)節(jié)寄生蟲(chóng)感染相似,Thl7/IL-17可能也具有調(diào)節(jié)某種病原微生物感染的功能,這還需要進(jìn)行更深入和細(xì)致的實(shí)驗(yàn)研究。

在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)病程進(jìn)展中,目前研究公認(rèn) Thl/h2比例是否平衡是機(jī)體能否有效清除病毒和病毒感染細(xì)胞的主要因素之一。Th細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡參與了 HBV感染后多種疾病狀況的發(fā)生、發(fā)展。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的 Th17細(xì)胞亞群在 HBV感染和CHB疾病的病理進(jìn)程以及與其所致的肝臟炎性損傷中發(fā)揮的作用目前僅有少量的文獻(xiàn)報(bào)道。日本 Yuki Yasumi等[6]報(bào)道,急性重型及暴發(fā)型肝損傷較急性普通型肝損傷血清IL-17升高,而急性普通型肝損傷與與正常人相比無(wú)差異,血清IL-17水平與急性暴發(fā)型肝損傷的凝血酶原活動(dòng)度相關(guān)。國(guó)內(nèi)邢直直等[7]報(bào)道,慢性乙型肝炎血清 IL-17水平高于于正常人,且與肝臟炎癥及纖維化程度相關(guān)。我們的研究表明接受干擾素治療的 HBeAg陽(yáng)性慢性乙肝患者血清IL-17較健康人無(wú)明顯升高,其原因可能為:所選患者其肝功多為輕度損害,此階段機(jī)體的免疫反應(yīng)很弱,Th17細(xì)胞在外周血 CD4+T細(xì)胞所占比例并不高,故其產(chǎn)生的 IL-17可能在血清中的水平非常低,直接對(duì)體內(nèi)狀況進(jìn)行檢測(cè)時(shí),并不能檢測(cè)到其微弱的變化情況。

目前有效抗乙肝病毒治療的方法大致分為以拉米呋啶為代表的核苷類(lèi)似物和以α-干擾素(Interferon alpha,IFN-α)為主的免疫分子治療兩大類(lèi)。α-干擾素因其直接抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用在用于臨床 20余年來(lái)一直是治療乙肝的一線藥物之一。研究表明α-干擾素是唯一一種經(jīng)過(guò)對(duì)照研究證實(shí)的能降低和清除慢性乙肝患者HBV感染(將HBsAg轉(zhuǎn)換為抗HBs,5%～ 8%)的藥物。在本研究顯示:HBeAg陽(yáng)性慢性乙肝患者干擾素治療過(guò)程中,應(yīng)答組 HBV DNA曲線呈總體下降趨勢(shì),其中在 4周時(shí)可見(jiàn)明顯下降趨勢(shì),4周后曲線呈緩慢下降趨勢(shì)。無(wú)應(yīng)答組 HBV DNA變化則無(wú)下降趨勢(shì),而是在基線水平小幅度波動(dòng);應(yīng)答組 ALT、AST在 4周時(shí)則有明顯上升,4周后曲線呈迅速下降趨勢(shì);而應(yīng)答組 HBeAg定量曲線為下降趨勢(shì),HBeAg定量曲線 12周前于基線水平波動(dòng),無(wú)明顯下降,12周后呈明顯下降趨勢(shì)。其 ALT、AST、HBV DNA及HBeAg變化情況與α-干擾素在不同時(shí)期的不同抗病毒機(jī)制有關(guān)。第一期病毒水平較快下降,主要是經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白,這些效應(yīng)分子通過(guò)抑制病毒 mRNA表達(dá)、RNA編輯、抑制病毒 RNA合成或引發(fā)病毒RNA降解實(shí)現(xiàn)抗病毒作用[8]。 ALT、AST迅速上升,可能反映免疫系統(tǒng)被激活而破壞感染的肝細(xì)胞。IFNα增強(qiáng)M HC-Ⅰ的表達(dá),從而優(yōu)化病毒抗原(核殼蛋白成分)在肝細(xì)胞表面的展現(xiàn)。已被病毒抗原激活的特異CT L,因病毒抗原的吸引而匯集于會(huì)內(nèi),識(shí)別同時(shí)提呈的M HC-Ⅰ和病毒核殼肽,從而破壞感染的肝細(xì)胞。同時(shí)外周血NK活性降低,可能由于NK細(xì)胞也進(jìn)入肝內(nèi)參與細(xì)胞毒作用。而IFNα治療的最初數(shù)小時(shí)內(nèi)MHC-Ⅰ糖蛋白即出現(xiàn)在肝細(xì)胞膜上,而 ALT則在以后的 5～ 8周才從治療前水平上升,提示清除感染肝細(xì)胞不僅需要表達(dá)其靶性(M HC-Ⅰ ),還需隨時(shí)間發(fā)生的其他免疫學(xué)改變。第二期病毒水平緩慢下降,相當(dāng)于免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。干擾素通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜上的 HLA表達(dá),增強(qiáng)其他免疫殺傷細(xì)胞的功能,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的分化和增殖,提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能和細(xì)胞毒活性,殺傷病毒感染細(xì)胞而清除病毒,調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)乙肝病毒的免疫應(yīng)答,在肝內(nèi)產(chǎn)生大量 Th1型細(xì)胞因子,IL-2和 IL-12誘導(dǎo)內(nèi)源性 IFNγ和TNF α,IFNγ和 TNFα可在肝細(xì)胞無(wú)損傷過(guò)程中清除病毒[9]。使得細(xì)胞內(nèi)的病毒得以清除,從而 HBeAg的生成也隨之減少;與此同時(shí),由于體液免疫的作用,機(jī)體會(huì)不斷產(chǎn)生抗-HBe,隨著 HBeAg的減少和抗-HBe的增多,機(jī)體則發(fā)生血清學(xué)的轉(zhuǎn)化。

本研究表明應(yīng)答組血清IL-17曲線為上升趨勢(shì),在18周前于基線水平波動(dòng),無(wú)明顯上升,18周后呈明顯上升趨勢(shì);且在HBeAg轉(zhuǎn)陰者中升高更明顯。提示IL-17可能在α-干擾素治療的第二個(gè)階段參與病毒的清除,并與其它細(xì)胞因子相互作用,充分激發(fā)免疫,以抑制感染肝細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制,增強(qiáng)復(fù)制病毒的清除,達(dá)到持久抑制病毒復(fù)制和表達(dá)。進(jìn)一步闡明其作用及機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步提高干擾素治療效果有深遠(yuǎn)的意義。

綜上所述,IL-17作為一種細(xì)胞因子,可能參與了干擾素抗病毒的后期的免疫調(diào)節(jié)作用,并很有可能在后期持久抗病毒中發(fā)揮重要作用。但由于慢性乙肝病毒感染的特殊性、機(jī)體免疫反應(yīng)的復(fù)雜性,干擾素作用機(jī)理的多樣性,Th17細(xì)胞分泌 IL-17體內(nèi)分布的不平衡性,IL-17在 HBV感染者體內(nèi)復(fù)雜的免疫系統(tǒng)中扮演的角色仍需我們進(jìn)一步探索。

[1]Infante-Duarte C,Horton HF,Byrne M C,et al.Microbial lipopeptides induce the production of IL-17 in Th cells[J].JImmunol,2000,165(11):6107-6115.

[2]Chen Z,Laurence A,Kanno Y,et al.Selective regulatory function of Socs3 in the formation of IL-17-secreting T cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(21):8137-8142.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南 [J].中華傳染病雜志,2005,23(6):421-431.

[4]Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,et al.Interleukin17-producing CD4+effector T cells develop via a line μ ge distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immunol,2005,6(11):1123-1132.

[5]Afzail G,Lombardi RI,Lechler and Lord GM.The role of helper 17(Th17)and r μgulatory T cells(Treg)in human o μgan transplantation and atuoimmune disease[J].Clin and Expe Immunol.2007,148(1):32-46.

[6]Yasumi Y,Takikawa Y,Endo R,et al.Interleukin-17 as a new marker of severity of acute hepatic injury[J].Hepatol Res,2007,37(4):248-254.

[7]邢直直,杜文軍,陳士俊.輔助性 T淋巴細(xì)胞 1、2、17在慢性乙型肝炎病毒感染狀態(tài)中的變化[J].中華傳染病雜志,2008,26(3):158-162.

[8]Kalvakolanu DV. Alternate interferon signaling pathways[J].Pharmacol Ther,2003,100(1):1-29.

[9]姜鳳良,張 潔,田明昆 ,等.乙肝病毒感染者血清 IL-2、IL-4、TNF-α的檢測(cè)及臨床意義 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2007,36(3):322-323.