武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 戶業(yè)麗 伍悅平 劉漢橋

綠色化工工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 程 波

湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呂 中

湖北天峽鱘業(yè)有限公司 藍(lán)澤橋

鋅是家禽體內(nèi)多種酶的組成成分或是輔助因子，可以調(diào)控這些酶的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響機(jī)體的許多代謝過程，還作為胰島素的組成成分參與體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝 （Hoover等，1997；Wedeking等，1990）。 氨基酸螯合鋅與無機(jī)鋅添加劑相比，具有生化穩(wěn)定性高，生物學(xué)效價(jià)高，增強(qiáng)動(dòng)物體的抗菌能力、免疫力等特點(diǎn)（吳玉臣等，2004；徐學(xué)明等，2002；Cao 等，2000）。 但由于其氨基酸來源有限且價(jià)格較高，限制了其在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

我國鱘魚資源豐富，鱘魚皮中氨基酸含量豐富且氨基酸比例易于吸收（程波等，2006），利用鱘魚加工廢棄物魚皮中復(fù)合氨基酸制備復(fù)合氨基酸螯合物具有一定開發(fā)潛力。因此，本文通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了微波法制備人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸螯合鋅的制備工藝，并對其產(chǎn)品進(jìn)行了紅外表征，為氨基酸鰲合鋅的開發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 人工養(yǎng)殖鱘魚魚皮，由天峽鱘業(yè)有限公司提供。

主要試劑：甲醛（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純）、硫酸鋅（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純）等。

主要儀器：WD800（L23）型微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司）、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器）、Mettler toledo 320-S型pH計(jì)、LD4-2A型低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、eppendorf centrifuge 5417R型冷凍微量離心機(jī)、TU-1800紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、BRUKER EQUINAX55傅立葉紅外光譜儀。

1.2 人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸水解液的制備

1.2.1 水解液的制備工藝 人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸水解液制備工藝見圖1。

圖1 人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸水解液的制備工藝

1.2.2 水解液中氨基酸含量的測定 采用甲醛滴定法進(jìn)行測定（中國標(biāo)準(zhǔn)出版社總編室，1990）。

1.3 微波法制備人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸螯合鋅

1.3.1 微波功率的測定 取1000 mL水，測量初始溫度為T1（℃），然后分別于低火、解凍、中火、高火、大火5個(gè)檔位下加熱2 min后，測量水溫為T2（℃），根據(jù)下式計(jì)算出不同檔位的微波功率。

式中P為微波功率，W；Q為微波加熱過程中水吸收的熱量，J；t為加熱時(shí)間，s；c 為水的比熱容，4.19 J/（g·℃）；T1為加熱前水的溫度，℃；T2為加熱后水的溫度，℃。

1.3.2 微波螯合反應(yīng) 取復(fù)合氨基酸水解液5 mL，根據(jù)條件加入一定量的硫酸鋅至微波反應(yīng)器中，密封，在一定的微波功率和微波時(shí)間下進(jìn)行螯合反應(yīng)。

1.4 單因素試驗(yàn)方案 選取影響微波螯合工藝的4個(gè)主要影響因素：pH、反應(yīng)時(shí)間、配位比、微波功率，以復(fù)合氨基酸螯合鋅的產(chǎn)率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)來確定各因素對螯合反應(yīng)的影響。

1.4.1 pH對微波螯合反應(yīng)的影響 取復(fù)合氨基酸與鋅配位比為2∶1、微波功率340 W、微波時(shí)間為 10 min 時(shí)，分別在 pH 為 4、6、8、10、12 的條件下，進(jìn)行微波螯合反應(yīng)。

1.4.2 微波功率對微波螯合反應(yīng)的影響 當(dāng)復(fù)合氨基酸與鋅配位為2∶1、pH為8、微波時(shí)間為10 min 時(shí)，分別在微波功率為 120、240、340、450、610 W的條件下，進(jìn)行微波螯合反應(yīng)。

1.4.3 微波時(shí)間對微波螯合反應(yīng)的影響 當(dāng)復(fù)合氨基酸與鋅配位比為2∶1、微波功率340 W、pH為8 時(shí)， 分別在微波時(shí)間為 4、6、8、10、12 min 的條件下，進(jìn)行微波螯合反應(yīng)。

1.4.4 配位比對微波螯合反應(yīng)的影響 當(dāng)微波功率340 W、pH為8、微波時(shí)間為10 min時(shí)，分別在復(fù)合氨基酸與鋅配位比 （復(fù)合氨基酸與硫酸鋅的摩爾比）為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 的條件下，進(jìn)行微波螯合反應(yīng)。

1.5 正交試驗(yàn)方案 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以5 mL的復(fù)合氨基酸水解液為反應(yīng)基準(zhǔn)，選取pH（A）、微波功率（B）、微波時(shí)間（C），復(fù)合氨基酸與鋅配位比（D）四個(gè)因素，采用 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以復(fù)合氨基酸螯合鋅的產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行微波法螯合工藝的研究，對微波法制備復(fù)合氨基酸螯合鋅的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，見表1。

表1 因素水平表

1.6 分析方法

1.6.1 螯合率的測定 螯合反應(yīng)結(jié)束后，乙醇沉淀出復(fù)合氨基酸螯合鋅，再用乙醇進(jìn)一步純化復(fù)合氨基酸螯合鋅，并用二硫腙試劑和茚三酮試劑定性地檢測游離金屬離子和游離氨基酸以鑒定純化效果（吳茹怡等，2006）。采用EDTA配位滴定法直接滴定純化后氨基酸螯合物中的金屬元素 （易凱等，2007），計(jì)算出樣品的螯合率。

1.6.2 螯合率及螯合產(chǎn)物總量的計(jì)算

1.6.2.1 樣品中鋅元素總量 從初制得的螯合產(chǎn)物（m，g）中稱取一定量（m1，g）作為樣品，滴定計(jì)算出其中的鋅元素總量（m2，g）。計(jì)算公式如下：

式中m2為樣品中鋅元素總量，g；C為標(biāo)準(zhǔn)EDTA溶液的濃度，mol/L；V0為滴定鋅元素總量所消耗的EDTA溶液的體積，mL；M1為鋅元素的摩爾質(zhì)量，g/mol；4為稀釋倍數(shù)。

1.6.2.2 螯合率 從初制得到的螯合產(chǎn)物（m，g）中稱取一定量（m1，g）作為樣品，純化后滴定螯合態(tài)鋅元素的含量，計(jì)算產(chǎn)物的螯合率。計(jì)算公式如下：

式中V1為滴定螯合態(tài)鋅元素所消耗的EDTA溶液的體積，mL；V0為滴定鋅元素總量所消耗的EDTA溶液的體積，mL。

1.6.2.3 螯合產(chǎn)物總量 由5 mL復(fù)合氨基酸水解液微波螯合所得螯合產(chǎn)物總量的計(jì)算公式為：

式中m為復(fù)合氨基酸螯合鋅的總量，g；m1為測得時(shí)所取的螯合鋅的量，g；m2為樣品中鋅元素總量，g；m3為螯合產(chǎn)物中所含復(fù)合氨基酸螯合鋅的量，g；M1為元素鋅的摩爾質(zhì)量，g/mol；M2為復(fù)合氨基酸螯合鋅的摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.7 紅外表征 采用KBr壓片法，對復(fù)合氨基酸螯合鋅在400～4000 cm-1進(jìn)行掃描，得到復(fù)合氨基酸螯合鋅的紅外吸收光譜。

1.8 紫外吸收 在200～400 nm進(jìn)行掃描，得到復(fù)合氨基酸螯合鋅的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸水解液的制備按1.2操作，制得淡黃色透明的人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸水解液，其中氨基酸含量為0.8900 mol/L。

2.2 微波功率的測定 按1.3.1方法，測得微波爐各檔位對應(yīng)的功率，結(jié)果見表2。

表2 微波功率的測定

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 pH對微波螯合反應(yīng)的影響 在一定的微波功率、微波時(shí)間、復(fù)合氨基酸與鋅配位比條件下，測定pH對螯合反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對螯合反應(yīng)的影響

由圖2可知，隨pH上升，螯合率增加，pH值在8左右時(shí)，螯合率達(dá)到最大；隨后，隨pH增加螯合率迅速下降。其原因可能是由于在體系偏酸的情況下，氨基酸的α-氨基帶正電荷，無電子對與鋅離子配位；而體系過堿的情況下，鋅離子易生成氫氧化鋅沉淀，影響了螯合反應(yīng)的進(jìn)行。

2.3.2 微波功率對微波螯合反應(yīng)的影響 在一定的pH、微波時(shí)間、復(fù)合氨基酸與鋅配位比條件下，測定微波功率對螯合反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 微波功率對螯合反應(yīng)的影響

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，微波功率對螯合反應(yīng)影響較大，提高微波功率可以增加螯合率。但當(dāng)功率升高到為反應(yīng)提供了足夠的能量后，增大功率對螯合效果的影響則不明顯。另外，過高的能量產(chǎn)生瞬時(shí)升高的溫度和熱能，可能對反應(yīng)不利。綜合考慮，微波功率為340 W時(shí)效果最佳。

2.3.3 微波時(shí)間對微波螯合反應(yīng)的影響 在一定的pH、微波功率、復(fù)合氨基酸與鋅配位比條件下，測定微波時(shí)間對螯合反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 微波時(shí)間對螯合反應(yīng)的影響

由圖4可以看出，微波時(shí)間延長，可增加螯合率，但時(shí)間增至10 min后，延長微波時(shí)間螯合率反而降低。這可能是由于螯合反應(yīng)是一種快速的反應(yīng)，且微波輻射能量較高，反應(yīng)迅速完成。由于是在密閉的微波反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)，物料內(nèi)部溫度過高，無法快速散熱，時(shí)間過長反而對反應(yīng)不利。因此需合理控制微波輻射時(shí)間，既節(jié)約能量，又達(dá)到較佳的螯合效果。

2.3.4 配位比對微波螯合反應(yīng)的影響 在一定的pH、微波功率、微波時(shí)間，測定復(fù)合氨基酸與鋅配位比對螯合反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5看出，復(fù)合氨基酸與鋅的配位比為2∶1時(shí)，螯合率最高。一般螯合反應(yīng)氨基酸與金屬離子的配位比過小，形成的螯合物不穩(wěn)定，配位比太大，氨基酸過量，成本增高。由圖5可知，復(fù)合氨基酸與鋅離子螯合的最佳配比為2∶1。

圖5 配位比對螯合反應(yīng)的影響

2.4 正交試驗(yàn) 結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由極差分析可知，各因素對微波螯合產(chǎn)量的影響程度依次為：復(fù)合氨基酸與鋅配位比>微波時(shí)間>微波功率>pH，對螯合率的影響程度依次為：復(fù)合氨基酸與鋅配位比>微波時(shí)間 >pH>微波功率。從螯合物產(chǎn)量和螯合率來分析，微波螯合的最佳條件均為：A2B3C3D2，即以統(tǒng)一基準(zhǔn)復(fù)合氨基酸水解液制得的氨基酸螯合物產(chǎn)量高，對應(yīng)的螯合效率也高。因此微波螯合的最佳工藝條件為：A2B3C3D2，即螯合體系的pH 8，微波功率為340 W，微波時(shí)間為10 min，復(fù)合氨基酸與硫酸鋅配位比為2∶1。在此條件下進(jìn)行螯合，得到類白色的復(fù)合氨基酸螯合鋅，其產(chǎn)量為0.6172 g，螯合率達(dá)68.72%。

2.5 人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸螯合鋅的紅外表征 采用KBr壓片法，對復(fù)合氨基酸螯合鋅在400～4000 cm-1進(jìn)行掃描，得到復(fù)合氨基酸和復(fù)合氨基酸螯合鋅的紅外吸收光譜見圖6和圖7。由圖6可見，復(fù)合氨基酸在3412.53 cm-1有由氨基（-NH2）的伸縮振動(dòng)引起的特征吸收，以及由羰基（-C=O）在1739.21 cm-1伸縮振動(dòng)引起的特征吸收。由圖7可見當(dāng)復(fù)合氨基酸與鋅螯合后，螯合物的紅外光譜顯示，氨基的吸收峰發(fā)生了明顯的紅移，移至3446.44 cm-1處。同時(shí)，羰基的吸收值大大增強(qiáng)，特征吸收移至1594.70 cm-1。這是由于復(fù)合氨基酸的氨基和羧基氧參與配位形成螯合物的結(jié)果，與苗敬芝等（2008）和張夏紅等（2006）的研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明了復(fù)合氨基酸鋅螯合物的生成。

2.6 人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸螯合鋅的紫外吸收 在200～400 nm下，對人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸螯合鋅的紫外吸收進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖鱘魚皮復(fù)合氨基酸螯合鋅在220～260 nm有紫外吸收，其最大紫外吸收波長為215 nm。

3 小結(jié)

圖6 復(fù)合氨基酸水解液的紅外吸收圖譜

圖7 復(fù)合氨基酸螯合鋅的紅外吸收圖譜

本試驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)得出微波螯合的最佳工藝條件為：反應(yīng)體系pH為8、微波功率為340 W、微波時(shí)間為10 min、復(fù)合氨基酸與硫酸鋅配位比為2∶1，在此條件下螯合得到復(fù)合氨基酸螯合鋅產(chǎn)量為0.6172 g，螯合率達(dá)68.72%。進(jìn)而對該產(chǎn)物進(jìn)行了紅外表征，驗(yàn)證了復(fù)合氨基酸螯合鋅的生成，同時(shí)確定了工養(yǎng)殖鱘魚復(fù)合氨基酸螯合鋅的最大紫外吸收波長為215 nm。

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