遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所 孫永欣

大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院 汪婷婷 徐永平＊

海參通過吞食周圍環(huán)境中的泥土和動(dòng)植物碎屑，在微生物的協(xié)助下完成繁重的消化吸收功能（Deming和 Colwell，1982）， 進(jìn)而轉(zhuǎn)化成自身的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分?，F(xiàn)已初步證實(shí)，刺參可以采食海藻，但其消化道中缺乏內(nèi)源性褐藻酸酶 （唐黎，2006）。孫奕和陳瑪（1989）報(bào)道，刺參腸道中的產(chǎn)褐藻酸酶菌占總菌數(shù)90%以上，在褐藻膠的降解中起到重要作用。本文考察黃芪多糖（APS）和不同粉碎粒徑黃芪對(duì)刺參腸道中產(chǎn)褐藻酸酶菌數(shù)量的影響，并通過體外試驗(yàn)進(jìn)一步研究APS對(duì)褐藻酸降解菌產(chǎn)酶活性的影響，為探討APS對(duì)刺參消化道中褐藻酸降解菌的調(diào)控及其消化生理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)刺參 試驗(yàn)用刺參體重為 （49.3±5.65）g，由大連太平洋海珍品養(yǎng)殖公司提供。于水槽（體積為300 L）中充氣暫養(yǎng)，每天更換1/3體積水，于傍晚投喂商品飼料，水溫保持在12～15℃。經(jīng)過2周適應(yīng)期，進(jìn)行正式養(yǎng)殖試驗(yàn)。

1.2 黃芪的預(yù)處理及試驗(yàn)日糧 采用3種制備工藝對(duì)黃芪進(jìn)行加工，即普通粉碎后過60目（250 μm）篩絹網(wǎng)制備成黃芪粗粉；粗粉經(jīng)振動(dòng)磨（中國(guó)倍力技術(shù)工程有限公司）粉碎過300目篩絹網(wǎng)制備成黃芪超微粉 （直徑為39～125 μm）；超微粉制備過程中添加堿性化學(xué)試劑制備成黃芪化微粉（直徑為39～125 μm）。將黃芪粗粉、超微粉和化微粉分別按的3.0%（m/m）劑量添加到基礎(chǔ)飼料制備成飼料1、飼料2和飼料3。APS由西安天園生物制劑廠提供，此多糖在黃芪干燥根中的平均含量約17%（曹建軍等，2006），以0.5%（m/m）劑量添加到基礎(chǔ)飼料中制備成飼料4，基礎(chǔ)日糧作為對(duì)照。試驗(yàn)中免疫增強(qiáng)劑添加劑量參考水產(chǎn)養(yǎng)殖無脊椎動(dòng)物中常用量。基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 正式試驗(yàn)采用循環(huán)流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)，每個(gè)養(yǎng)殖單位為0.1 m3水族箱，每個(gè)水族箱中放置15只刺參，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，共使用15個(gè)水槽。養(yǎng)殖試驗(yàn)共60 d，期間循環(huán)水流量為500～800 mL/min，每天更換總體積1/3的水以保證水質(zhì)。試驗(yàn)采用避光養(yǎng)殖，水溫控制在16～18℃。每天投喂量為約占個(gè)體體重的3%。

1.4 腸道微生物試驗(yàn)

1.4.1 體內(nèi)試驗(yàn)菌種來源 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后從各組刺參腸道中分離獲得。

1.4.2 2216E海洋細(xì)菌培養(yǎng)基 蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，磷酸高鐵0.001%，瓊脂粉1.5%，溶于過0.22 μm濾膜的海水中，調(diào)pH值至7.6～7.8后滅菌，倒平板。

1.4.3 褐藻酸鈉選擇性培養(yǎng)基 褐藻酸鈉0.5%，（NH4）2SO40.5%、K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、NaCl 2.5%、瓊脂 1.3%、FeSO4·7H2O 0.01%、調(diào)節(jié)pH 7.5為褐藻酸降解菌的篩選培養(yǎng)基。

1.4.4 體外試驗(yàn)用初篩培養(yǎng)基 同1.4.3。

1.4.5 體外試驗(yàn)用復(fù)篩培養(yǎng)基 液體種子培養(yǎng)基（龐敏等，2007）：蛋白胨 0.5%，酵母提取物0.1%，褐藻酸鈉0.5%，NaCl 3%，調(diào)節(jié)pH至7.5；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：褐藻酸鈉 0.5%，（NH4）2SO40.5% ，K2HPO40.2% ，MgSO4·7H2O 0.2% ，NaCl 2.5%，調(diào)節(jié) pH 7.5。

1.4.6 體外試驗(yàn)用APS APS（98%）分別按0%、0.05%、0.1%、0.2%添加到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.4.7 體外試驗(yàn)用菌種來源 從對(duì)照組刺參腸道泥樣中分離獲得。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異顯著。

1.6 方法

1.6.1 體內(nèi)試驗(yàn)菌株的培養(yǎng) 每組各取3只，先用無菌水將刺參表面沖洗干凈，用手術(shù)刀剖開腹腔，用鑷子小心將消化道取出，擠出泥樣，稱取1.0 g，將其用稀釋液（滅菌陳海水）稀釋（10-1～10-9）；同時(shí)將刺參腸道組織用滅菌陳海水沖洗干凈，稱取1.0 g置于勻漿器中，加入1 mL稀釋液充分研磨后再加入8 mL稀釋液搖勻，繼續(xù)做適度稀釋（10-1～10-9）。將腸道組織及泥樣適當(dāng)稀釋倍數(shù)溶液分別取10 μL點(diǎn)于兩種平板上，每個(gè)板上點(diǎn)9滴 （2216E平板點(diǎn)樣的稀釋倍數(shù)為10-7～10-9；褐藻酸鈉選擇性培養(yǎng)基點(diǎn)樣的稀釋倍數(shù)為10-1～10-3）。將點(diǎn)樣后的平板置于25℃恒溫培養(yǎng)24 h。采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌定量。

1.6.2 體外試驗(yàn)菌株的初篩 取對(duì)照組刺參3只，解剖后取腸道組織，將中后腸部分中泥樣擠出，無菌操作將采集的樣品置于5 mL離心管中，用滅菌海水進(jìn)行10-1稀釋。將樣品再按照10-2～10-5不等梯度進(jìn)行稀釋，取各稀釋液0.1 mL涂布到初篩分離平板上。25℃恒溫培養(yǎng)48 h，選取具有透明圈的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.6.3 體外試驗(yàn)菌株的復(fù)篩 將初篩出的菌株接入100 mL種子培養(yǎng)基（250 mL三角瓶）中，25℃150 r/min培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液3 mL接入200 mL含不同濃度APS的發(fā)酵培養(yǎng)基（500 mL三角瓶）中發(fā)酵培養(yǎng)。在25℃，150 r/min下培養(yǎng) 48 h，8000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清用 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定酶活。

1.6.4 褐藻酸酶活力測(cè)定 參照龐敏等（2007）的方法。

1.6.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確稱取100℃干燥至恒重的葡萄糖0.10 g，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，配成1.00 mg/mL濃度的溶液，按表2在各25 mL比色管中加入溶液，沸水浴反應(yīng)3 min，冷卻加蒸餾水定容至25 mL后，以去離子水作為空白校正，用紫外分光光度計(jì)于520 nm下測(cè)吸光度值。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法 mL

1.6.4.2 樣品測(cè)定 將全部菌液4℃離心后取上清液進(jìn)行酶活力測(cè)定。以反應(yīng)液中還原糖的增加量作為檢測(cè)酶活力的指標(biāo)。

還原糖的測(cè)定采用DNS改良法。具體步驟：取0.5%褐藻酸鈉溶液0.5 mL，加入0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液2 mL、酶液2 mL，40℃水浴中糖化30 min，取出后立即置于沸水中水浴15 min使酶失活，得糖化液。取糖化液1 mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法加顯色劑比色。同時(shí)以1 mL煮沸的酶液代替酶做空白對(duì)照。

以無水葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)試驗(yàn)組和對(duì)照組的差值計(jì)算還原糖的產(chǎn)生量。1個(gè)酶活力單位定義為：每分鐘產(chǎn)生1 μg還原糖所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻酸降解菌在腸道中總異養(yǎng)菌中的比重從表3可見，添加不同飼料添加劑飼養(yǎng)的刺參腸道組織總異養(yǎng)菌數(shù)和褐藻酸降解酶菌數(shù)相差較大，APS組褐藻酸降解菌的相對(duì)量最大，其他4組較為接近。

2.2 產(chǎn)褐藻酸酶菌在腸道泥樣總異養(yǎng)菌中的比重 從表4可見，試驗(yàn)各組的刺參腸道泥樣中總異養(yǎng)菌數(shù)和褐藻酸降解菌數(shù)相差較大，從相對(duì)量比值可以看出，APS組褐藻酸降解菌相對(duì)量最大，較其他4組高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

表3 各組刺參腸道中產(chǎn)褐藻酸酶菌的相對(duì)量

表4 各組刺參腸道泥樣中產(chǎn)褐藻酸酶菌的相對(duì)量

2.3 體外試驗(yàn)中APS對(duì)產(chǎn)酶菌密度和酶活力的影響 見圖1。無APS組中，褐藻酸酶活力較低，而添加APS后可提高產(chǎn)褐藻酸酶菌的產(chǎn)酶活力和生物量。在各試驗(yàn)組中，隨著APS濃度的增加，相對(duì)酶活力和生物量呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中0.1%的添加組酶活力和生物量最高。

圖1 不同濃度APS對(duì)產(chǎn)褐藻酸酶菌產(chǎn)酶活力和生物量的影響

3 討論

褐藻酸酶也稱為褐藻酸裂解酶，主要存在于微生物和食藻的海洋軟體動(dòng)物（如海螺、鮑、銼石鱉等）消化道中（劉晨光等，2000），現(xiàn)已從九孔鮑內(nèi)臟器官中分離純化出褐藻酸酶 （吳永沛和何碧煙，2002）。研究發(fā)現(xiàn)，在刺參消化道中可檢測(cè)到該酶活性，但從幼體到成參褐藻酸酶活力一直處于較低水平（王吉橋等，2007）。孫奕和陳瑪?shù)龋?989）研究表明，刺參腸道內(nèi)具有降解褐藻膠活性的細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的90%以上，這些細(xì)菌在褐藻膠的降解中起著重要作用。因此，刺參對(duì)褐藻膠消化主要依賴于腸道微生物。

從本試驗(yàn)中可以看出，不同組別刺參腸道中細(xì)菌數(shù)相差很大，由于刺參消化道中微生物主要來源于吞食的食物中，因此消化道中的微生物組成和生物量也很不穩(wěn)定。孫奕和陳瑪（1989）研究表明，刺參在饑餓狀態(tài)下其腸道中細(xì)菌屬數(shù)目比正常攝食狀態(tài)下減少50%以上。盡管各組中總異養(yǎng)菌和產(chǎn)褐藻酸酶菌生物量差別較大，APS組中產(chǎn)褐藻酸酶菌比例最高。從刺參腸道泥樣中發(fā)現(xiàn)，總異養(yǎng)菌數(shù)高于腸道中菌數(shù)，至少表明刺參腸道能富集來源于食物中的細(xì)菌。孫奕和陳瑪（1989）、張紅梅等（2003）研究表明，海泥中極少見到的柄桿菌屬在饑餓刺參后腸中存在比例較高，這些腸道定植菌在刺參營(yíng)養(yǎng)吸收、排斥其他菌群的繁殖等方面可能具有一定作用。刺參腸道中的泥樣屬于未完全消化的食物，其中不僅含有大量外來的細(xì)菌，還含有腸道中定植下來的細(xì)菌，因此數(shù)量高于腸道菌數(shù)。APS組中褐藻酸降解菌數(shù)比例明顯高于其他各組，這與腸道中的情況相一致。此外，本試驗(yàn)中褐藻酸降解菌在總異養(yǎng)菌中所占的比例遠(yuǎn)低于90%，這與刺參所處的生活環(huán)境有直接關(guān)系。由于天然狀態(tài)下，底泥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)非常豐富導(dǎo)致細(xì)菌種類和數(shù)量繁多，底泥中的常見菌——弧菌屬和假單胞菌屬都具有很強(qiáng)的褐藻酸降解活性，被刺參攝入后在消化道中定植下來（孫奕和陳瑪，1989），而這些菌在經(jīng)過砂濾罐多次過濾后數(shù)量大大減少，刺參在無法攝入足夠的細(xì)菌的情況下，其體內(nèi)褐藻酸降解菌自然不足。此外，褐藻酸降解菌可在海藻藻體上大量富集（龐敏等，2007），天然條件下，刺參攝食海藻會(huì)帶入大量的褐藻酸降解菌，但在試驗(yàn)條件下，人工飼料中該菌的含量會(huì)大為下降，這也是刺參體內(nèi)褐藻酸降解菌比例很低的原因。

為了進(jìn)一步闡明APS對(duì)褐藻酸降解菌的作用機(jī)制，本研究中采用了體外試驗(yàn)考察APS對(duì)褐藻酸降解菌生物量和產(chǎn)酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加APS后，褐藻酸降解菌生物量隨著APS濃度增加先上升后下降，產(chǎn)酶活力也伴隨著生物量而先上升后下降，因此APS可以作為褐藻酸降解菌的益生素，通過促進(jìn)褐藻酸降解菌的生長(zhǎng)、繁殖進(jìn)而提高產(chǎn)酶活力。這也是多糖類物質(zhì)通過調(diào)節(jié)腸道中微生物區(qū)系發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的主要原因（Helena等，2004）。在本試驗(yàn)中，褐藻酸降解菌生物量先升高后降低分析可能是生物量達(dá)到一定程度后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間所限，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因此生物量下降。在本試驗(yàn)中，0.1%添加劑量最佳。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加APS能有效促進(jìn)刺參腸道中褐藻酸降解菌生長(zhǎng)，且0.1%添加量效果最佳，因此在人工養(yǎng)殖中可以通過飼料中添加APS改善腸道菌群從而提高其消化利用率。

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