劉艷民，李 杰，李慶和，李慧吉，韓 娟

010000 內(nèi)蒙古師范大學(xué)（李 杰）

300193 天津中醫(yī)藥大學(xué)（李慧吉，韓 娟）

近年來，用心理應(yīng)激源為刺激，以即刻早期基因（IEG）中的c-fosmRNA的表達(dá)作為基因細(xì)胞代謝活動(dòng)標(biāo)志，對(duì)心理應(yīng)激的腦機(jī)制開展了大量的研究。心理應(yīng)激作用與大腦改變腦的內(nèi)分泌機(jī)能，其中最重要的途徑是下丘腦—垂體—腎上腺軸（HPA）被激活，下丘腦室旁核部位的c-fos表達(dá)可能作為第三信使調(diào)節(jié)CRF表達(dá)，進(jìn)而控制ACTH的分泌，啟動(dòng)HPA軸，影響與應(yīng)激有關(guān)的行為、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動(dòng)。研究證明應(yīng)激可通過植物神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)兩條途徑影響胰島素抵抗和β細(xì)胞功能，進(jìn)而影響2型糖尿病發(fā)生。然而中樞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)如何影響糖尿病發(fā)生的通路還未完全明了。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)中血糖變化，我們推測(cè)心理應(yīng)激引起2型糖尿病病生理改變的機(jī)制可能與激活大腦IEG表達(dá)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用原位雜交技術(shù)，觀察心理應(yīng)激對(duì)下丘腦室旁核即刻早期基因（cfos）mRNA和CRFmRNA表達(dá)的影響，同時(shí)觀察了心身5號(hào)對(duì)其表達(dá)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wister大鼠120只，體質(zhì)量120～150g。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第四研究所提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動(dòng)物室內(nèi)自然光照。室溫保持24℃,通風(fēng)良好。飼以全價(jià)營(yíng)養(yǎng)料，自由進(jìn)食飲水，除實(shí)驗(yàn)應(yīng)激外無(wú)其他不良刺激。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型 120只大鼠隨機(jī)分為兩組，一組為40只，另一組為80只。80只大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，溶解在0.1 mol/L檸檬酸緩沖液內(nèi)，pH為4.0），30 mg/kg,1次/d，連續(xù)2 d（參考《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》）。余40只大鼠注射等量檸檬酸緩沖液，1次/d，連續(xù)2 d。注射30日后測(cè)查大鼠空腹血糖，以9.3 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)（參考《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》），篩除高血糖鼠，再隨機(jī)選取45只STZ鼠和20只正常鼠進(jìn)入應(yīng)激造模實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物分組 全部動(dòng)物共分為5組，其中45只STZ大鼠隨機(jī)分為3組，即單純STZ組（無(wú)應(yīng)激）、STZ+應(yīng)激組、中藥組（STZ＋應(yīng)激），15只/組。20只正常大鼠分為應(yīng)激組和正常組，10只/組。

1.2.3 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)方法 參照Carter等[1]、姚樹橋等[2]方法，改良后建立本實(shí)驗(yàn)應(yīng)激方法。

1）限制：將大鼠放入20 cm×5 cm×5 cm塑料筒中，水平置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，保證大鼠不受壓。以不能回轉(zhuǎn)身為度，但其運(yùn)動(dòng)受限制，光線晦暗，限制刺激每周隨機(jī)擇時(shí)進(jìn)行3次，每次45 min。2）旋轉(zhuǎn)：利用舊式唱機(jī)改裝為旋轉(zhuǎn)器，轉(zhuǎn)速為45 r/min，在此轉(zhuǎn)速下離心力最小，避免離心力過大傷害大鼠。旋轉(zhuǎn)時(shí)將大鼠置于代謝籠中。旋轉(zhuǎn)刺激每45～150 min內(nèi)擇時(shí)進(jìn)行1次，每次15～20 min。旋轉(zhuǎn)刺激隔日進(jìn)行1次。3）擁擠：標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼養(yǎng)籠，按應(yīng)激組15只/籠，非應(yīng)激組5只/籠喂養(yǎng)。刺激貫穿于實(shí)驗(yàn)全過程，持續(xù)6周。

2 中藥制備和給藥方法

心身5號(hào)由旋覆花、代赭石、陳皮、茯苓、半夏、竹茹、丹參、赤芍、降香、烏藥、栝樓、遠(yuǎn)志、炙枇杷葉、合歡皮、知母、蒼術(shù)、龍齒、黃芩組成，自動(dòng)煎煮機(jī)煎煮，濃縮后置于-20℃冰箱貯藏備用。中藥組大鼠灌胃2 mL/次（其生藥濃度為960g/L），2次/d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，余組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，2次/d。

3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

3.1 下丘腦即刻早期基因c-fosmRNA表達(dá)測(cè)定 主要試劑：c-fosmRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒（天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心提供）。實(shí)驗(yàn)操作步驟：常規(guī)脫水，浸蠟，包埋。切片厚度為5 um，置于預(yù)先用多聚賴氨酸處理過的載玻片上。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。3%雙氧水（H2O2）室溫處理10 min，滅活內(nèi)源性過氧化酶。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的復(fù)合消化液（1 mL 3%檸檬酸加入2滴濃縮型復(fù)合消化液，混勻），37℃消化5～20 min。暴露目的基因mRNA核酸片段。0.5 mol PBS洗3次×5 min。蒸餾水洗1次。雜交盒中加入5～10 mL蒸餾水。每張切片加20 uL含CRF寡聚核苷酸探針雜交液。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在玻片上。恒溫箱37℃雜交30～120 min。雜交后揭去蓋玻片。30～37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×3次。

每張切片取2 uL雜交探針穩(wěn)定液A和18 uL雜交探針穩(wěn)定液B，混勻，加在切片上，濕盒中37～40℃反應(yīng)20 min。2×SSC洗滌5 min×3次。滴加封閉液，37℃20 min。甩去多余液體，不洗。滴加兔抗地高辛，37℃60 min。0.5 mol PBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃20 min。0.5 mol PBS洗2 min×3次。滴加 SABC，37℃ 20 min。0.5 mol PBS洗2 min×4次。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加在標(biāo)本上。顯色20～30 min。蘇木素復(fù)染，充分水洗。乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

4 下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）mRNA表達(dá)測(cè)定

主要試劑、實(shí)驗(yàn)試劑配置、實(shí)驗(yàn)步驟同上。

5 統(tǒng)計(jì)分析

采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)（由武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司提供），對(duì)各組動(dòng)物下丘腦室旁核切片進(jìn)行定量分析。隨機(jī)選取各組下丘腦室旁核6～7視域，于400倍高倍鏡下，以0.2073 um像素點(diǎn)長(zhǎng)，在1.219×103um2測(cè)量窗下，測(cè)取棕色反應(yīng)物的面數(shù)密度、總數(shù)目、總面積、平均灰度值，分析下丘腦室旁核內(nèi)c-fosmRNA和CRFmRNA表達(dá)的相對(duì)水平。測(cè)量數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達(dá)量比較 見表1。

表1 各組大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組相比 ★★P＜0.01，與應(yīng)激組相比◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與單純 STZ 組相比 ▲▲P＜0.01，與 STZ+應(yīng)激組相比☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別正常組應(yīng)激組單純STZ組STZ+應(yīng)激組中藥組n 10 10 12 15 14總面積52.17±17.42 281.69±96.89★★219.59±65.02 391.48±71.69▲▲◆303.44±27.72☆總數(shù)目1.17±0.408 6.50±1.871★★2.83±0.408 11.83±3.971▲▲◆◆5.50±1.225☆☆面數(shù)密度9.57±3.35 47.69±16.13★★23.24±3.37 89.07±32.58▲▲◆45.12±10.05☆☆

6.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達(dá)量比較 見表2。

表2 各組大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組相比★★P＜0.01，與單純STZ組相比▲▲P＜0.01；與應(yīng)激組相比◆P＜0.05，與 STZ+應(yīng)激組相比☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別正常組應(yīng)激組單純STZ組STZ+應(yīng)激組中藥組n 10 10 12 15 14總面積37.84±9.58 219.22±86.58★★138.79±33.72 300.57±176.46▲▲181.99±62.08☆總數(shù)目1.33±0.516 5.61±1.966★★2.33±0.516 8.67±2.658▲▲◆3.83±0.753☆☆面數(shù)密度9.57±3.35 54.69±16.13★★19.14±4.23 71.07±21.79▲▲◆31.43±6.17☆☆

7 討論

研究證實(shí)，應(yīng)激誘導(dǎo)的c-fos表達(dá)多見于室旁核背、腹側(cè)富含CRF和ACTH神經(jīng)元的小細(xì)胞區(qū)[3]。Imaki等[4]用c-fosmRNA探針研究PVA在束縛應(yīng)激后c-fosmRNA水平變化的時(shí)程關(guān)系，c-fosmRNA及CRFmRNA水平變化的時(shí)程關(guān)系，c-fosmRNA的最高水平在應(yīng)激開始后120～180 min，且c-fosmRNA和CRFmRNA的表達(dá)是同步增加的。根據(jù)這些研究資料，有人推測(cè)CRFmRNA就是c-fos的下游靶基因[5]，當(dāng)心理應(yīng)激發(fā)生時(shí)，下丘腦首先被激活，在PVN有c-fos和c-jun mRNA轉(zhuǎn)錄，繼而表達(dá)FOS和JUN蛋白，F(xiàn)OS與JUN蛋白形成二聚體，作為第三信使與CRFmRNA啟動(dòng)子上AP-1位點(diǎn)結(jié)合，激活CRFmRNA，使下丘腦PVN小細(xì)胞分泌神經(jīng)元分泌CRF，啟動(dòng)HPA軸。

本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激刺激可引起正常大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA轉(zhuǎn)錄活動(dòng)增強(qiáng)，下丘腦室旁核CRFmRNA表達(dá)同步增加，尤其STZ＋應(yīng)激組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的含量增加更顯著，推測(cè)可能是應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦PVN中c-fosmRNA表達(dá)及FOS蛋白合成增多，結(jié)果引起其下游靶基因CRFmRNA表達(dá)增多，激活HPA軸所致。由于STZ大鼠存在心理和病理雙重應(yīng)激作用，因而各項(xiàng)指標(biāo)含量增加更明顯。因此我們認(rèn)為不良心理應(yīng)激誘發(fā)2型糖尿病大鼠發(fā)病可能與應(yīng)激激活HPA軸中c-fosmRNA和CRFmRNA在細(xì)胞分子水平表達(dá)過多有關(guān)[4-5]。

針對(duì)心身疾病共同的病機(jī)為氣機(jī)失調(diào)（主要以氣滯、氣逆為主）及由其所產(chǎn)生的瘀血、寒結(jié)、熱結(jié)或寒熱互結(jié)的基本病理變化，同時(shí)結(jié)合糖尿病自身的病機(jī)特點(diǎn)為陰虛燥熱，課題組提出理氣降逆，散結(jié)活血，滋陰清熱為糖尿病的基本治則，并擬定心身5號(hào)方藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明心身5號(hào)具有干預(yù)心理應(yīng)激引起HPA通路的激活的作用，間接證實(shí)心理應(yīng)激誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病基本病機(jī)氣機(jī)失調(diào)的客觀存在，應(yīng)激激活HPA軸中c-fosmRNA和CRFm－RNA在細(xì)胞分子水平表達(dá)過多可能是其客觀實(shí)質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)說明心身5號(hào)既可整體調(diào)整氣機(jī)，又對(duì)具體疾病有所專攻，是治療心身疾病糖尿病的有效臨床方劑。

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