孟祥君,俞聯(lián)平,程文定,王國生

（甘肅省草原技術(shù)推廣總站,甘肅 蘭州 730010）

①紅三葉Tri folium pratense為豆科車軸草屬[1]多年生牧草,又名紅車軸草、紅荷蘭翅搖、金菜花、紅花苜蓿等。紅三葉中富含異黃酮類化合物,具有抗腫瘤（胃癌、乳腺癌）,防治骨質(zhì)疏松、改善更年期綜合癥等作用[2],具有較高的藥用價(jià)值。岷山紅三葉作為甘肅省具有地域特點(diǎn)的優(yōu)良豆科牧草和藥用植物,不僅產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu),且富含異黃酮,經(jīng)甘肅省草原技術(shù)推廣總站化驗(yàn)室檢測,岷山紅三葉中異黃酮含量為1.0%～2.6%,是大豆異黃酮（0.1%～0.3%）的近10倍[3],同時(shí)由于其傳統(tǒng)自然的生產(chǎn)方式,不存在轉(zhuǎn)基因問題和除草劑、殺蟲劑等污染,符合安全無公害生產(chǎn)的要求,存在巨大的藥用價(jià)值和綠色保健品開發(fā)潛力。

異黃酮作為豆科作物生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物,其含量受植物本身、溫度、肥力等許多因素的影響,如紫外線輻射、磷素缺乏、長期冷凍處理等都可有效刺激豆科作物異黃酮合成[4]。

接種專用根瘤菌是提高紫花苜蓿Medicago sativa等豆科牧草產(chǎn)量及品質(zhì)最重要的方法之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年生物固氮量達(dá)1.75×108t,為世界工業(yè)氮肥產(chǎn)量的4.37倍[5],目前美國有80%的紫花苜蓿在種植之前進(jìn)行根瘤菌接種,在加拿大和澳大利亞,紫花苜蓿接種根瘤菌技術(shù)已經(jīng)被普遍接受[5]。接種根瘤菌將成為未來提高豆科牧草產(chǎn)量和品質(zhì),改善和提高土壤肥力的重要農(nóng)藝措施。然而針對紅三葉等豆科牧草藥用價(jià)值開發(fā),目前還沒人就根瘤菌及其接種方式對豆科牧草異黃酮含量的影響進(jìn)行專題研究。

試驗(yàn)采用L9（34）正交設(shè)計(jì),立足岷山生態(tài)氣候和土壤條件,研究不同根瘤菌梯度、接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量及單位面積產(chǎn)量的影響,對指導(dǎo)甘肅省藥用紅三葉生產(chǎn)具有重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況試驗(yàn)在甘肅省定西南部特優(yōu)牧草種子基地（岷縣奔直寺,34°17′N,104°02′E）進(jìn)行,該基地海拔2 492 m,年平均氣溫5.7℃,年均降水量600 mm,無霜期112 d,年均日照時(shí)數(shù)2 229.6 h,≥10℃年有效積溫1 771℃·d。土質(zhì)為亞高山草甸土,有機(jī)質(zhì)含量為1.43%,總氮0.2%,速效磷12 mg/kg,pH值6.7,適宜種植紅三葉、貓尾草Phleum pratense等優(yōu)良牧草。

1.2 試驗(yàn)材料試驗(yàn)用牧草品種選用岷山紅三葉（Mingshan）。氮肥為尿素（蘭州化工廠生產(chǎn)）。接種根瘤菌由北京森迪科技產(chǎn)品開發(fā)公司提供（每克含菌量200億）。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),進(jìn)行根瘤菌梯度（A）、接種方式（B）和氮肥梯度（C）三因素,在3個(gè)不同水平的組合,對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積異黃酮產(chǎn)量的影響,試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理,每個(gè)處理各設(shè)2個(gè)重復(fù),共18個(gè)小區(qū)（表1）。另設(shè)一列D為空列,未安排試驗(yàn)因素,其作用是反映試驗(yàn)誤差。小區(qū)面積3.0 m×4.0 m。

施氮處理：由于當(dāng)?shù)赝寥烙袡C(jī)質(zhì)和氮素含量較高,土壤比較肥沃,播種前試驗(yàn)地均未施氮肥,播種時(shí),尿素一次性施于小區(qū)土表后耙地,耬耙深度2～3 cm。

根瘤菌處理：1）播種時(shí)將根瘤菌施于土表后耙地；2）播種時(shí)將根瘤菌稀釋2倍,和種子拌勻,開溝撒播后覆土；3）深2 cm處施入根瘤菌后播種。

表1 L9（34）正交設(shè)計(jì)表

1.4 播種及田間管理2007年5月16日播種,行距40 cm,條播,播種量 18 kg/hm2,常規(guī)田間管理。

1.5 異黃酮含量和單位面積異黃酮產(chǎn)量的測定2008年7月20日,采集盛花期岷山紅三葉的植物地上部分,干燥箱烘干,粉碎,過40目網(wǎng)篩。采用紫外分光光度法[6-7],在波長260 nm處對岷山紅三葉異黃酮含量進(jìn)行測定。

盛花期每小區(qū)隨機(jī)選取1 m×1 m樣方刈割,自然風(fēng)干,稱取風(fēng)干質(zhì)量,換算成單位面積產(chǎn)量（kg/hm2）。利用盛花期單位面積岷山紅三葉產(chǎn)量及該時(shí)期各處理異黃酮含量計(jì)算單位面積異黃酮產(chǎn)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS軟件（13.0版）進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 直觀分析L9（34）正交試驗(yàn)測定結(jié)果見表2。由表 2直觀分析可知,RA（1.34）＞RC（1.08）＞RB（0.89）＞RD（0.52）,說明 A 、B、C三因素對指標(biāo)的影響是確定的,且A因素是影響異黃酮含量和產(chǎn)量的主要因素,其次為C因素。

2.2 異黃酮含量分析各處理方差分析結(jié)果見表3。分析結(jié)果顯示,A因素（根瘤菌梯度）對岷山紅三葉異黃酮含量存在顯著影響（P＜0.05）,以A2（16 g/kg）水平組最高,A2顯著高于A1（0）和A3（32 g/kg）水平組,分別較A1和A3水平高29.1%和33%,A2和A3之間差異不顯著（P＞0.05）,說明在岷山紅三葉生產(chǎn)中,接種適宜數(shù)量（16 g/kg）的根瘤菌對提高岷山紅三葉異黃酮含量具有一定的作用；接種方式對岷山紅三葉異黃酮含量的影響差異不顯著,但具有依表施（B1）、拌種（B2）、深 2 cm處施入（B3）根瘤菌的次序增加的趨勢,以深2 cm處施入根瘤菌效果較好；氮肥對岷山紅三葉異黃酮含量也不存在顯著影響,與 C1（0）組相比,C2（42 kg/hm2）組具有降低的趨勢,而C3（84 kg/hm2）組異黃酮含量與C1相近。

2.3 單位面積異黃酮產(chǎn)量分析各處理單位面積異黃酮產(chǎn)量分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)測定結(jié)果

表3 不同處理方式各生產(chǎn)指標(biāo)方差分析結(jié)果表

試驗(yàn)結(jié)果表明：接種根瘤菌對岷山紅三葉單位面積異黃酮產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05）,以A2水平組最高,A1水平組最低,A2顯著高于A1水平組 ,較 A1高 53.02%,較 A3高 22.94%,而 A3與A1和A2之間差異均不顯著；接種方式、氮肥施用量對岷山紅三葉單位面積異黃酮產(chǎn)量無顯著影響,其中B2和B3組單位面積異黃酮產(chǎn)量相近,較B1組高 。

2.4 最優(yōu)水平組合選擇以上分析結(jié)果表明：接種根瘤菌對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積產(chǎn)量均存在顯著影響（P＜0.05）,并且都在A2（16 g/kg）水平組異黃酮含量和單位面積產(chǎn)量最高；雖深2 cm處施入根瘤菌異黃酮含量較高,但拌種方式可獲得較高的單位面積異黃酮產(chǎn)量,且施用時(shí)操作比較方便；在不施氮肥的情況下均能獲得較高的異黃酮含量和產(chǎn)量。因此綜合考慮根瘤菌梯度、接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和產(chǎn)量的影響,在岷縣自然生態(tài)和土壤條件下,以每千克岷山紅三葉種子與16 g根瘤菌肥料種,不施氮肥效果較優(yōu)。

3 討論

根瘤菌是豆科植物根系上生長的細(xì)菌,與豆科植物具有特殊的互利共生關(guān)系,宿主為根瘤菌提供良好的居住環(huán)境、碳源和能源以及其他必需營養(yǎng),而根瘤菌則為宿主提供氮素營養(yǎng)。目前豆科牧草與其相應(yīng)的根瘤菌共生固氮的研究已在紫花苜蓿、紅豆草Onobrychris vicaefolia和紅三葉等牧草上取得了進(jìn)展,肯定接種根瘤菌可提高豆科作物的根瘤數(shù)和結(jié)瘤率（尤其在牧草生長早期）,具有提高豆科牧草產(chǎn)量、改善其營養(yǎng)成分和品質(zhì)的作用,并能改善和提高土壤肥力[8-11]。然而就根瘤菌及其接種方式對紅三葉等豆科牧草異黃酮含量影響的研究目前尚未見報(bào)道。該試驗(yàn)結(jié)果顯示,根瘤菌梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積異黃酮產(chǎn)量存在顯著影響（P＜0.05）,接種適宜數(shù)量（16 g/kg）的根瘤菌對提高岷山紅三葉異黃酮含量和產(chǎn)量具有一定的作用。

McMurray等[12]報(bào)道,當(dāng)紅三葉缺磷時(shí),芒柄花素含量比施肥處理（23和96 kg/hm2）高；也有試驗(yàn)表明,施氮、磷、鉀肥均具有降低豆科牧草中異黃酮含量的趨勢[13],不施氮肥或氮肥施用量為75 kg/hm2時(shí),單位面積的異黃酮產(chǎn)量最高[14]。就本試驗(yàn)而言,氮肥施用量為0～84 kg/hm2,與試驗(yàn)所報(bào)道[13-14]的0～75 kg/hm2的施用量接近,未表現(xiàn)出明顯差異和規(guī)律,有必要在更大尺度上做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

4.1試驗(yàn)結(jié)果表明,根瘤菌梯度（A）、接種方式（B）和氮肥梯度（C）對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積異黃酮產(chǎn)量影響大小的排列次序?yàn)锳＞C＞B。接種根瘤菌對岷山紅三葉異黃酮含量和產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）,以每千克岷山紅三葉種子接種16 g根瘤菌效果較好。

4.2接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和產(chǎn)量不存在顯著影響,根瘤菌拌種和不施氮肥均能獲得較高的異黃酮含量和產(chǎn)量。

4.3綜合考慮根瘤菌梯度、接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和產(chǎn)量的影響,在岷縣生態(tài)氣候和土壤條件下,藥用岷山紅三葉生產(chǎn)以每千克岷山紅三葉種子施用16 g根瘤菌,拌種,不施氮肥的組合最優(yōu)。

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