譚文斐，田阿勇，王俊科，曹學(xué)照，馬 虹

(中國醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110001)

氯化鋰能夠抑制糖原合成酶-3β(GSK-3β)，對蛋白激酶的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)［1］，進(jìn)而影響 tau蛋白磷酸化。近些年，術(shù)后認(rèn)知功能障礙逐漸成為研究熱點，但是，對于手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)如何影響與記憶有關(guān)的tau蛋白的研究并不多見。研究提示，手術(shù)創(chuàng)傷引發(fā)了大鼠短暫的記憶下降，并且伴隨有海馬內(nèi)炎性因子的釋放［2］。因此，探討手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)海馬炎性因子是否通過GSK-3β通路介導(dǎo)tau病理變化是很有意義的。

1 材料與方法

1.1 動物和手術(shù) 150只♂ 6月齡SD大鼠吸入異氟烷麻醉誘導(dǎo)后氣管插管，機械通氣維持異氟烷濃度為1.5%，麻醉期間保持大鼠直腸溫度在(36～37)℃。大鼠隨機分為4組:健康對照組(group A，n=15);麻醉組(group B，n=45);手術(shù)和氯化鈉組(group C，n=45)，異氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化鈉;手術(shù)和氯化鋰組(group D，n=45)，異氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化鋰 200 mg·kg－1［3］，從實驗開始持續(xù)至術(shù)后7 d，每天1次。氯化鈉組給予同等容積的氯化鈉。B、C、D組所有動物均麻醉2 h，B組麻醉2 h后即刻處死，C，D 組手術(shù)后 1、3、7 d處死(15只/時點)。每個時點標(biāo)記為 B1、B3、B7、C1、C3、C7、D1、D3 和 D7。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR 按照參考文獻(xiàn)［4］，利用 Applied Biosystems(ABI公司，美國)系統(tǒng)進(jìn)行實時定量 PCR。大鼠 IL-1β上游引物:5'-ATCCCAAACAATACCCA-3'，下游引物:5'-CAACTATGTCCCGACCA-3';TNF-α上游引物:5'-CCACGC TCTTCTGTCTACTG-3'，下 游 引 物:5'-GCTACGGGCTTGTCACTC-3';3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物:5'-GCAAGTTCAACGGCACA-3'，下 游 引 物:5'-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3'。PRISM 7500HT檢測系統(tǒng)(ABI公司，美國)進(jìn)行熒光測定，以 GAPDH為對照，IL-1β mRNA和 TNF-α mRNA 為 測 試，對 循 環(huán) 數(shù) Ct值 計 算 后 (比 值(測試/對照)=2Ct對照－Ct測試)進(jìn)行比較。

1.2.2 Western blot 按照參考文獻(xiàn)［5］，海馬組織用溶解液勻漿處理后提取蛋白。蛋白提取物置入加樣緩沖液，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。分別與一抗(1∶500，Signalway Antibody，美國)4℃過夜。其后，膜與辣根過氧化物酶結(jié)合二抗室溫孵育2 h。最后膜與ECL系統(tǒng)曝光，成像。以β-actin的光密度值做為內(nèi)參照，采用目標(biāo)條帶與β-actin的光密度值比值做為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)炎性反應(yīng) 與A組比較，B組各時點IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β 和 TNF-α 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，C組、D 組術(shù)后 IL-1β mRNA、TNF-α mRNA和IL-1β的表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，見 Tab 1。

Tab 1 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA and protein(±s，n=5)

Tab 1 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA and protein(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs group A

Group IL-1β mRNA TNF-α mRNA IL-1β TNF-α A 1.04 ±0.05 1.20 ±0.07 0.60 ±0.01 0.39 ±0.01 B1 1.26 ±0.05 1.34 ±0.05 0.62 ±0.01 0.38 ±0.01 B3 1.44 ±0.05 1.26 ±0.05 0.60 ±0.02 0.40 ±0.01 B7 1.40 ±0.10 1.24 ±0.05 0.61 ±0.01 0.41 ±0.02 C1 2.52 ±0.08＊＊ 1.47 ±0.04＊＊ 1.15 ±0.05＊＊ 0.40 ±0.01 C3 1.54 ±0.09＊＊ 1.22 ±0.08 0.59 ±0.02 0.39 ±0.03 C7 1.14 ±0.05 1.22 ±0.04 0.58 ±0.01 0.40 ±0.01 D1 2.46 ±0.09＊＊ 1.48 ±0.01＊＊ 0.98 ±0.03＊＊ 0.40 ±0.03 D3 1.54 ±0.05＊＊ 1.24 ±0.05 0.59 ±0.02 0.39 ±0.02 D7 1.16 ±0.09 1.22 ±0.04 0.59 ±0.03 0.40 ±0.02

Tab 2Expression of site-specific phosphorylation of tau and GSK-3β(±s，n=5)

Tab 2Expression of site-specific phosphorylation of tau and GSK-3β(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs group A

Group Total tau pT205 pS396 GSK-3β pGSK-3β A 76 ±0.02 B1 1.14 ±0.04 1.22 ±0.03 0.96 ±0.02 0.91 ±0.04 0.76 ±0.03 B3 1.12 ±0.04 1.23 ±0.05 0.97 ±0.05 0.91 ±0.04 0.79 ±0.07 B7 1.14 ±0.05 1.21 ±0.04 0.96 ±0.01 0.91 ±0.05 0.77 ±0.07 C1 1.14 ±0.05 1.23 ±0.08 0.97 ±0.06 0.92 ±0.02 0.76 ±0.04 C3 1.15 ±0.02 4.53 ±0.05＊＊ 2.15 ±0.03＊＊ 0.90 ±0.06 0.34 ±0.08＊＊C7 1.14 ±0.02 1.22 ±0.06 0.96 ±0.06 0.89 ±0.04 0.76 ±0.06 D1 1.14 ±0.04 1.22 ±0.01 0.97 ±0.01 0.91 ±0.04 0.75 ±0.08 D3 1.14 ±0.04 1.23 ±0.02 0.95 ±0.05 0.89 ±0.06 0.76 ±0.07 D7 1.14 ±0.02 1.22 ±0.05 0.95 ±0.05 0.91 ±0.02 0 1.16 ±0.04 1.22 ±0.01 0.97 ±0.03 0.91 ±0.02 0..76 ±0.07

2.2 炎癥反應(yīng)通過激活GSK-3β誘發(fā)tau蛋白磷酸化 與A 組比較，B 組各時點 tau、pT205、pS396、GSK-3β 和 p-GSK-3β的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，C組術(shù)后pT205和 pS396的表達(dá)上調(diào)，而 p-GSK-3β表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)。D組給予氯化鋰后 pT205、pS396和 p-GSK-3β的表達(dá)恢復(fù)對照水平，說明GSK-3β活性抑制后 tau蛋白磷酸化水平恢復(fù)，見Tab 2。這些結(jié)果提示，炎性因子對 tau蛋白磷酸化的影響是通過GSK-3β介導(dǎo)的。

3 討論

Tau蛋白在非神經(jīng)源性細(xì)胞中的過度表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］，而磷酸化 tau蛋白可以誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞病理變化［7］，損害記憶形成。脾切除術(shù)可反映切除一個器官的手術(shù)創(chuàng)傷，同時脾又是一個免疫器官，實施脾切除術(shù)大鼠海馬內(nèi)激活炎性因子的釋放［2］。有研究表明GSK-3β可以被炎性因子 IL-1β和TNF-α激活，導(dǎo)致蘇氨酸205位點 tau蛋白磷酸化增加［8］。還有研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰可通過誘導(dǎo)失活形式的 p-GSK-3β表達(dá)增高而抑制GSK-3β的活性，進(jìn)而抑制Tau蛋白磷酸化［5］。這些結(jié)果都支持本研究結(jié)論。

本研究發(fā)現(xiàn)接受脾切除的大鼠，海馬內(nèi)炎性因子可以激活GSK-3β，誘發(fā) tau蛋白高度磷酸化。利用氯化鋰抑制GSK-3β的活性，可以使高度磷酸化的tau蛋白恢復(fù)正常對照組水平。氯化鋰可能成為治療術(shù)后認(rèn)知功能障礙的臨床策略中一個選擇。

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