楊瑞瑞，喬蓉霞，杜宏偉，李卓敏

(1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710061; 2.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710043)

補(bǔ)腦丸是由酸棗仁、當(dāng)歸、枸杞子、肉蓯蓉、五味子等多味中藥組成的復(fù)方制劑，具有滋補(bǔ)精血、健腦益智、安神鎮(zhèn)驚、化痰熄風(fēng)的功效，臨床上用于治療迷惑健忘、記憶減退、頭暈、耳鳴、心煩失眠、心悸不寧、癲癇頭痛、神煩胸悶等癥[1]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有當(dāng)歸、五味子等幾味藥材的顯微特征鑒別。為了更好地控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，筆者分別采用薄層色譜(TLC)法和反相高效液相色譜(RPHPLC)法進(jìn)行了定性定量研究，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters－Alliance 2695－2487型(YY01520041103)高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (Alltech ELSD 2000)。酸棗仁皂苷A對(duì)照品(批號(hào)為 110734－200509)、酸棗仁皂苷 B對(duì)照品(批號(hào)為1110814－200506)、枸杞子對(duì)照藥材(批號(hào)為121072－0301)、松果菊苷對(duì)照品(批號(hào)為111670－200401)、當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)為120927－200310)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;補(bǔ)腦丸樣品及陰性樣品均由西安正大制藥有限公司提供。乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別(TLC法)

當(dāng)歸:取當(dāng)歸對(duì)照藥材1 g，加乙醚20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液;取本品適量，除去包衣，研細(xì)，取1 g，加乙醚20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液;取不含當(dāng)歸的陰性樣品1 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖1 A)。

圖1 補(bǔ)腦丸中當(dāng)歸、肉蓯蓉及枸杞子的薄層色譜圖

肉蓯蓉:取松果菊苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液;取本品適量，除去包衣，研細(xì)，取1 g，加甲醇20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至近干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液;取不含肉蓯蓉的陰性樣品1 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇－醋酸－水(2∶1∶7)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖1 B。)

枸杞子:取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，加水50 mL，加熱煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯25 mL振搖提取，提取液濃縮至約1 mL，作為對(duì)照藥材溶液;取本品適量，除去包衣，研細(xì)，取5 g，加水50 mL，加熱煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯25 mL振搖提取，提取液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。取不含枸杞子的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸(10∶5∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖1 C)。

酸棗仁:取酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液;取2.2.2項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液，取不含酸棗仁的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制備溶液，作為陰性對(duì)照品溶液。吸取酸棗仁皂苷A對(duì)照品溶液與酸棗仁皂苷B對(duì)照品溶液各5 μL，供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，在100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖2)。

圖2 補(bǔ)腦丸中酸棗仁薄層色譜圖

2.2 酸棗仁皂苷A含量測(cè)定(RP－HPLC法)

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:乙腈 －水 (33 ∶67);流速:1.0 mL/min;氣流:2.5 mL/min;漂移管溫度:110℃。

2.2.2 溶液制備

精密稱取酸棗仁皂苷A對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的對(duì)照品溶液。取本品適量，除去包衣，研細(xì)，精密稱取5 g，置索氏提取器中，加乙醚適量回流提取3 h，棄去醚液;藥渣揮盡殘醚，再加甲醇適量回流提取5 h;甲醇提取液置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，分?jǐn)?shù)次定量轉(zhuǎn)移到分液漏斗中;用水飽和的正丁醇提取5次，每次15 mL;合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的氨水(取40 mL濃氨溶液加水稀釋到100 mL，再用正丁醇飽和，分取下層液)洗滌2次，每次50 mL，棄去洗液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50 mL，正丁醇提取液置水浴上蒸干;殘?jiān)蛹状既芙?，定量轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取不含酸棗仁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):取2.2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖3。可見，供試品溶液色譜在與酸棗仁皂苷A對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間有一致的色譜峰，陰性對(duì)照品溶液無干擾。

線性關(guān)系考察:精密稱取酸棗仁皂苷A對(duì)照品 12.45 mg，置 25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為 0.498 mg/mL 的對(duì)照品溶液，按擬訂的色譜條件分別進(jìn)樣 1，2，5，10，15，20，25，30，40，50 μL，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積，以峰面積的對(duì)數(shù)值與進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸，得回歸方程 Y=1.4102 X+5.7014，r=0.999(n=10)。結(jié)果表明酸棗仁皂苷A進(jìn)樣量線性范圍是0.498 ～ 24.9 μg。

圖3 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD為4.01%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，于24 h內(nèi)分別進(jìn)樣5次。結(jié)果峰面積的 RSD為4.80%(n=5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):精密取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果的 RSD為5.33%(n=6)。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取重復(fù)性試驗(yàn)樣品細(xì)粉共7份，每份2.5 g，分別精密加入酸棗仁皂苷A對(duì)照品溶液(0.4265 mg/mL)1 mL，揮干，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 酸棗仁皂苷A加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=7)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取從市場(chǎng)上收集到的13批樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定酸棗仁皂苷A含量。結(jié)果見表2，可見，平均含量為0.1022 mg/g。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

補(bǔ)腦丸中的酸棗仁[2]具有養(yǎng)心安神的功效，其中所含的酸棗仁皂苷A及酸棗仁皂苷B為有效成分之一，兩成分的含量測(cè)定方法多采用薄層掃描法[3]，近年來有人采用HPLC法測(cè)定。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[4－5]，用HPLC法對(duì)補(bǔ)腦丸主要藥味酸棗仁中的酸棗仁皂苷A進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

在預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)供試品溶液制備中的取樣量、提取溶劑、提取時(shí)間、除雜溶劑及用量等進(jìn)行了多因素考察，結(jié)果以乙醚脫脂、甲醇提取、正丁醇萃取、氨溶液除雜質(zhì)為較優(yōu)條件;對(duì)色譜條件也進(jìn)行了優(yōu)化，比較了甲醇－水系統(tǒng)和乙腈－水系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈－水(33 ∶67)為優(yōu)。

TLC鑒別中，當(dāng)歸、枸杞子用對(duì)照藥材作對(duì)照，均能得到滿意的層析結(jié)果;肉蓯蓉因有兩種，選用松果菊苷和毛蕊花糖苷作對(duì)照，薄層色譜不完全一致，樣品中在與毛蕊花糖苷斑點(diǎn)相同位置有干擾，故只選松果菊苷作對(duì)照;酸棗仁皂苷B在含量測(cè)定中量較小，未作為控制指標(biāo)，故增加在TLC鑒別中。

[1]WS3－B－1949－95，中華人民共和國衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第十冊(cè))·補(bǔ)腦丸[S].

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:254.

[3]尹清茹，張永玲.薄層掃描法測(cè)定咽炎丸中酸棗仁皂苷的含量[J].中國藥業(yè)，1999，8(8):34 －35.

[4]鐘東會(huì)，雷根虎，郭五保，等.RP－HPLC測(cè)定酸棗仁中的酸棗仁皂苷A的含量[J].中成藥，2004，26(11):963－964.

[5]李會(huì)軍，李 萍.高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定酸棗仁皂苷A及B的含量[J].藥物分析雜志，2000，20(2):82－84.