孫寶丹，董 斌，王 旭，郭興杰

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

半胱氨酸是一種具有巰基基團(tuán)的天然氨基酸，僅在220 nm波長處有末端吸收[1]，采用液相色譜紫外檢測法難以達(dá)到高檢測靈敏度。因此，許多文獻(xiàn)采用柱前衍生化高效液相色譜法測定半胱氨酸的含量[2]。為了提高半胱氨酸的測定靈敏度，筆者用4－氯－7－硝基 －2，1，3－苯并二唑(NBD－Cl)作為柱前衍生化試劑制備半胱氨酸衍生物，在Sumichiral OA－2500S手性柱上分離兩對映體，建立左旋半胱氨酸原料藥中右旋異構(gòu)體雜質(zhì)的檢查方法，并對影響對映體分離的因素進(jìn)行了研究和討論。

1 儀器與試藥

Jasco高效液相色譜儀，PU－2080型高壓泵，Jasco UV－2075型紫外檢測器(日本分光公司);Sepu 3000色譜工作站(山東金普分析儀器有限公司);pHS－3DC型精密數(shù)顯酸度計(jì)(上?？茖W(xué)公司)。L－半胱氨酸對照品、D－半胱氨酸對照品、L－半胱氨酸原料(遼寧一成藥業(yè)有限公司);NBD－Cl(New Jersey，USA);甲醇、乙腈(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)，其他試劑均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Sumichiral OA －2500S 柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇(含15 mmol/L檸檬酸)－乙腈溶液(10∶90，V/V);流速:0.8 mL/min;柱溫:室溫;檢測波長:470 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 溶液制備

稱取0.31 g硼酸和0.37 g氯化鉀，溶于30 mL水中，用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，用水定容至50 mL，即得硼酸鹽緩沖液。用硼酸鹽緩沖溶液為溶劑，制備質(zhì)量濃度為300 μg/mL的 D－半胱氨酸對照品貯備液和質(zhì)量濃度為600 μg/mL的 L－半胱氨酸對照品貯備液;分別吸取上述貯備液適量，用硼酸鹽緩沖液稀釋制成質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的 D－半胱氨酸和 L－半胱氨酸混合對照品溶液;吸取 D－半胱氨酸對照品貯備液適量，用硼酸鹽緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的對照品溶液(置4℃冰箱中保存)。精密稱取NBD－Cl適量，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為16 mmol/L的NBD－Cl溶液，置4℃冰箱中避光保存待用。

2.3 衍生化反應(yīng)

取氨基酸溶液 400 μL，加入 NBD －Cl溶液 300 μL，于 60 ℃水浴中避光反應(yīng)60 min，4℃冷卻，氮?dú)獯蹈?，加流動? mL復(fù)溶，0.2μm 濾膜濾過。

2.4 檢測條件優(yōu)化

衍生化條件:使用質(zhì)量濃度為300 μg/mL的 L－半胱氨酸對照品溶液考察了影響衍生化反應(yīng)的因素[3－4]。結(jié)果表明，衍生化試劑濃度、衍生溶液pH、衍生化溫度及時(shí)間對衍生化產(chǎn)率均有影響。優(yōu)化的衍生化條件為NBD－Cl的濃度為16 mmol/L，衍生溶液pH為8.0，衍生化溫度及時(shí)間分別為60℃和60 min。

色譜條件:設(shè)定甲醇中檸檬酸濃度為5 mmol/L，考察了甲醇與乙腈比例在10∶90至50∶50范圍內(nèi)對氨基酸對映體分離的影響。由表1可知，隨著乙腈比例的增加，氨基酸對映體保留時(shí)間明顯縮短，但分離度和選擇性因子改變不大。因此，考慮到乙腈比例再增加會影響檸檬酸在流動相中的溶解，最后選擇甲醇與乙腈比例為10∶90。甲醇中檸檬酸濃度對對映體分離也有影響[5－6]。設(shè)定甲醇與乙腈比例為10∶90，考察了檸檬酸濃度(0～20 mmol/L)對氨基酸對映體分離的影響。流動相中不含檸檬酸時(shí)，對映體保留時(shí)間過長;檸檬酸濃度增加，對映體保留時(shí)間減小，分離度減小。綜合考慮保留時(shí)間和分離度，最后選擇檸檬酸濃度為15 mmol/L。

表1 甲醇和乙腈的不同比例對分離的影響

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

專屬性試驗(yàn):取混合對照品溶液和 D－半胱氨酸對照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法操作，制備NBD－半胱氨酸衍生物，同時(shí)制備空白溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖見圖1?？梢姡珼－半胱氨酸和 L－半胱氨酸達(dá)到完全分離，按 L－半胱氨酸計(jì)理論板數(shù)為8400;空白衍生化試劑在半胱氨酸保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明衍生化試劑對測定無干擾。

線性關(guān)系考察:精密量取 D－半胱氨酸對照品貯備液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，置 100 mL 量瓶中，加硼酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻。按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 Y=70523 X －385，R2=0.9992(n=5)。結(jié)果表明，D－半胱氨酸質(zhì)量濃度在1.2～6.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。方法的最低檢測限為2.5 ng，最低定量下限為6 ng。

重復(fù)性試驗(yàn):分別量取 D－半胱氨酸和 L－半胱氨酸對照品貯備液適量，稀釋制成含 D－半胱氨酸3 μg/mL和 L－半胱氨酸300 μg/mL的混合對照品溶液6份，按2.3項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析。結(jié)果峰面積的 RSD為1.9%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

回收率試驗(yàn):取 200 μL質(zhì)量濃度為600 μg/mL的 L－半胱氨酸對照品貯備液，分別加入 200 μL 質(zhì)量濃度為 3，6，9 μg/mL的 D－半胱氨酸對照品溶液(n=9)，作為供試品溶液，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，依法測定并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為102.5%，RSD 為 3.0%(n=9)，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 樣品雜質(zhì)檢查

取 L－半胱氨酸原料藥適量，精密稱定，加硼酸鹽緩沖溶液溶解制成每1 mL中約含300 μg L－半胱氨酸的溶液，作為供試品溶液;另精密量取D－半胱氨酸對照品貯備液適量，用硼酸鹽緩沖溶液稀釋成每 1 mL 中含 3.0 μg D－半胱氨酸的溶液，作為對照溶液。精密量取對照溶液 20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分的峰高約為滿量程的20%;另取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分完全出峰，按外標(biāo)法計(jì)算 L－半胱氨酸中 D－異構(gòu)體的含量，即得。結(jié)果表明，本研究所用的 L－半胱氨酸原料藥中未檢出右旋體雜質(zhì)。

圖1 半胱氨酸衍生化產(chǎn)物色譜圖

3 討論

本研究首次采用NBD－Cl對半胱氨酸進(jìn)行柱前衍生，并使用OA手性色譜柱分離半胱氨酸衍生物對映體。在此基礎(chǔ)上，建立了L－半胱氨酸原料藥中右旋異構(gòu)體雜質(zhì)的檢查方法，為控制 L－半胱氨酸的光學(xué)純度提供了保證。

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