于遵波，張艷，吳銀良*

(1．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040)

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克倫特羅在豬體內(nèi)立體選擇性降解行為研究

于遵波1，張艷2，吳銀良2*

(1．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040)

為了解克倫特羅在豬體內(nèi)是否存在立體選擇性降解行為，手性分離制備了克倫特羅單一對(duì)映體，然后對(duì)生豬進(jìn)行飼喂含有克倫特羅外消旋體(2.0 mg/kg)和單一對(duì)映體(1.0 mg/kg)的飼料，7 d后進(jìn)行屠宰，定期采集豬的肌肉、肝臟、腎臟、心臟、肺臟和尿液，測(cè)定克倫特羅對(duì)映體含量。結(jié)果表明，克倫特羅在豬體內(nèi)存在立體選擇性降解行為，肝臟、腎臟和肺臟中對(duì)映體(右旋體/左旋體)比例較高，心臟和肌肉中的對(duì)映體比例相對(duì)較低；休藥3 d時(shí)，肝臟、腎臟、豬尿中的對(duì)映體比例均處于最高點(diǎn)。同時(shí)克倫特羅對(duì)映體在豬體內(nèi)不存在相互轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。該研究為科學(xué)評(píng)估動(dòng)物性食品殘存的克倫特羅對(duì)人體健康造成的危害提供了科學(xué)依據(jù)。

克倫特羅；手性對(duì)映體；立體選擇性降解；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

克倫特羅(Clenbuterol)俗稱“瘦肉精”，屬于選擇性β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，生產(chǎn)中常用其外消旋體非法應(yīng)用于畜牧業(yè)，用來提高酮體瘦肉率。然而，由于克倫特羅易在動(dòng)物組織中形成殘留，曾多次發(fā)生嚴(yán)重的人畜中毒事故[1-2]。因此，克倫特羅在我國(guó)已禁止使用，但因其促生長(zhǎng)效果好，違法使用的情況還時(shí)有發(fā)生。然而目前在評(píng)估克倫特羅對(duì)人體健康造成的危害時(shí)，對(duì)其是手性藥物這一特征未加以充分考慮，僅對(duì)該藥物作為純的單一化合物來看待[3-5]。而手性藥物不同異構(gòu)體之間在毒性、致畸、致癌、致突變上往往存在差異，必然導(dǎo)致對(duì)其危害估計(jì)不是過高就是過低[6-8]。因此為更加科學(xué)評(píng)估該藥物對(duì)人體健康造成的危害，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行立體選擇性降解行為進(jìn)行研究。

隨著動(dòng)物性食品安全得到全社會(huì)的重視，國(guó)際上對(duì)于獸用的手性藥物在動(dòng)物體內(nèi)的立體選擇性降解行為研究有所升溫，如Smith DJ分別對(duì)克倫特羅在雞和豬中的立體選擇性降解行為進(jìn)行了研究，但豬體內(nèi)豬肉樣品僅提供了0天的數(shù)據(jù)[9]，同時(shí)也未進(jìn)行單一對(duì)映體飼喂試驗(yàn)；Cristofol C等研究了牛靜脈注射阿苯噠唑后代謝產(chǎn)物阿苯噠唑亞砜在體液和組織中對(duì)映異構(gòu)體比例隨時(shí)間變化情況[10]；但這些研究對(duì)單一對(duì)映體在畜禽體內(nèi)是否存在轉(zhuǎn)化現(xiàn)象缺乏進(jìn)一步的研究。而在國(guó)內(nèi)，對(duì)于手性藥物在動(dòng)物體內(nèi)的立體選擇性降解行為和機(jī)理研究較少，僅有周志強(qiáng)課題組對(duì)手性農(nóng)藥在兔子和大鼠中的立體選擇性降解行為和機(jī)理進(jìn)行了研究和探索，而對(duì)獸用手性藥物在使用對(duì)象(畜禽)體內(nèi)的立體選擇性代謝規(guī)律的研究尚為空白。為進(jìn)一步探明克倫特羅在豬肉中的立體選擇性降解行為和了解單一對(duì)映體在畜禽體內(nèi)是否存在轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，本研究在建立豬組織克倫特羅對(duì)映體殘留量分析方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了克倫特羅在豬體內(nèi)立體選擇性降解試驗(yàn)。通過研究，首次明確克倫特羅單一對(duì)映體在豬體內(nèi)不存在對(duì)映體轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和材料 Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；固相萃取儀(美國(guó)SUPELCO公司)；Sigma離心機(jī)(北京博勵(lì)行儀器有限公司)；勻質(zhì)器(德國(guó)IKA公司)，-Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。鹽酸克倫特羅(99%)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；鹽酸克倫特羅-D9(100 μg/L)購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇(色譜純)購(gòu)于美國(guó)默克公司；甲酸(色譜純)購(gòu)于美國(guó)天地有限公司；SCX (500 mg/3 mL)購(gòu)于Supelco公司；其他試劑均為分析純?cè)噭?。空白豬肉樣品購(gòu)于寧波市江東區(qū)歐尚超市，實(shí)驗(yàn)用肉豬為健康肉豬，體重70 kg左右，用藥前測(cè)定是否含克倫特羅。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(500 μg/mL) 準(zhǔn)確稱取含100.0 mg克倫特羅的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，單一克倫特羅對(duì)映體濃度為500 μg/mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液 將外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成2、10、20、50、100、200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液含內(nèi)標(biāo)濃度為25 μg/L)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

1.3.1 單一對(duì)映異構(gòu)體的制備 對(duì)映異構(gòu)體制備色譜分離條件：流動(dòng)相：V(甲醇)：V(乙酸)：V(三乙胺)=99.98：0.01：0.01，進(jìn)樣量50 μL，柱溫30 ℃。在此條件下，先出峰的為(-)-對(duì)映體，后出峰的為(+)-對(duì)映體，收集單一對(duì)映異構(gòu)體。合并流出液，旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入甲醇溶解并定容至50 mL，根據(jù)上述色譜條件，在240 nm處測(cè)定兩對(duì)映異構(gòu)體濃度。

1.3.2 動(dòng)物試驗(yàn)方法

1.3.2.1 飼料配制 將上述外消旋體儲(chǔ)備液和1.3.1項(xiàng)中兩對(duì)映異構(gòu)體溶液分別和500 g經(jīng)粉碎的豬配合飼料混合，振蕩混合2 h后，在60 ℃烘箱中烘干。再在動(dòng)物試驗(yàn)前，與養(yǎng)殖場(chǎng)提供的豬飼料混合，飼料中外消旋體的濃度為2.0 mg/kg，單一對(duì)映異構(gòu)體的濃度為1.0 mg/kg。

1.3.2.2 喂藥和取樣時(shí)間 外消旋體實(shí)驗(yàn)和單一對(duì)映體實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)均為6頭，用含有藥物的飼料連續(xù)飼喂7 d后進(jìn)行屠宰，分別于0，3，7，14，21和28 d采集每頭豬的肌肉、肝臟、腎臟、心臟、肺臟和尿液。

1.3.3 測(cè)定方法 降解試驗(yàn)樣品中克倫特羅對(duì)映體濃度的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[11]，所有組織樣品測(cè)定方法均一致，豬尿樣品取樣量為5.0 mL。整個(gè)方法中僅對(duì)流動(dòng)相的流速作了調(diào)整，由1.0 mL/min改為0.5 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一對(duì)映異構(gòu)體的制備 經(jīng)測(cè)定，制備的單一對(duì)映異構(gòu)體甲醇溶液中(-)-對(duì)映體和(+)-對(duì)映體的濃度分別為1499 μg/mL和1529 μg/mL，經(jīng)計(jì)算質(zhì)量分別為74.95 mg和76.45 mg。

2.2 外消旋體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 外消旋體的樣品測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果和對(duì)映異構(gòu)體比例均詳見表1，從表1中可見，0 d時(shí)(-)-對(duì)映體和(+)-對(duì)映體的濃度均是豬尿中最高，然后(-)-對(duì)映體依次是肺臟、肝臟、腎臟、心臟和肌肉，(+)-對(duì)映體依次是肝臟、肺臟、腎臟、心臟和肌肉。28 d降解后，除肺臟中的(+)-對(duì)映體濃度高于1.0 μg/kg外，其余組織和尿液中的(-)-對(duì)映體和(+)-對(duì)映體濃度均低于1.0 μg/kg。同時(shí)從表中可見，肝臟、腎臟和肺臟中對(duì)映異構(gòu)體比例較高，心臟和肌肉中的對(duì)映異構(gòu)體比例相對(duì)較低；休藥3 d時(shí)，肝臟、腎臟、豬尿中的對(duì)映異構(gòu)體比例均處于最高點(diǎn)。外消旋體實(shí)際樣品測(cè)定圖譜詳見圖1，從圖中可見(-)-對(duì)映體和(+)-對(duì)映體峰形和分離均較好。

表1 克倫特羅外消旋體樣品測(cè)定結(jié)果和對(duì)映體比例

圖1 鹽酸克倫特羅外消旋體0 d肺臟和0 d肝臟MRM色譜圖(1.(-)-克倫特羅-D9對(duì)映體；2.(+)-克倫特羅-D9對(duì)映體；3.(-)-克倫特羅對(duì)映體；4.(+)-克倫特羅對(duì)映體)

2.3 單一對(duì)映體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 單一對(duì)映體的樣品測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表2，從表2中可見，(-)-對(duì)映體和(+)-對(duì)映體單一實(shí)驗(yàn)時(shí)，均不存在在豬體內(nèi)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象；同時(shí)從表2可知，(-)-對(duì)映體實(shí)驗(yàn)時(shí)0 d測(cè)定結(jié)果肺臟中含量最高，其次是豬尿、肝臟、腎臟、心臟和肌肉，(+)-對(duì)映體實(shí)驗(yàn)時(shí)0 d測(cè)定結(jié)果肝臟中含量最高，其次是肺臟、豬尿、腎臟、心臟和肌肉。28 d降解后，(-)-對(duì)映體實(shí)驗(yàn)時(shí)，除肝臟樣品中的濃度為1.06 μg/kg外，其余樣品均低于1.0 μg/kg；(+)-對(duì)映體實(shí)驗(yàn)時(shí)，除腎臟和肺臟樣品中的濃度分別為1.03 μg/kg和1.34 μg/kg外，其余樣品均低于1.0 μg/kg。

表2 克倫特羅單一對(duì)映體實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果

續(xù)表

3 討論和小結(jié)

3.1 單一對(duì)映體的制備 目前市場(chǎng)上尚無法購(gòu)買到單一克倫特羅對(duì)映體原料藥或標(biāo)準(zhǔn)品，為達(dá)到進(jìn)行單一對(duì)映體實(shí)驗(yàn)的需要，必須通過手性分離制備出克倫特羅單一對(duì)映體?？紤]到本實(shí)驗(yàn)對(duì)單一對(duì)映體需要量不是特別大，本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行進(jìn)樣，手性色譜柱(Astec CHIROBIOTICTMV)分離，分別收集兩個(gè)組分來制備單一對(duì)映體。

3.2 外消旋體實(shí)驗(yàn) 對(duì)于β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑來說，引起副作用或急性毒性的主要成分是其左旋異構(gòu)體，而通過外消旋體實(shí)驗(yàn)可知，克倫特羅左旋異構(gòu)體代謝較快，特別是在肝臟、腎臟和肺臟組織中所占比例較小，因此在科學(xué)評(píng)估肝臟、腎臟和肺臟組織中殘存的該藥物對(duì)人體健康造成的危害時(shí)，有必要對(duì)其進(jìn)行對(duì)映異構(gòu)體分析。從本實(shí)驗(yàn)的肌肉中克倫特羅對(duì)映體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，評(píng)估肌肉中殘存的該藥物對(duì)人體健康造成的危害時(shí)，對(duì)映異構(gòu)體分析的必要性較小。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，外消旋體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Smith DJ等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[9]；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)首次證明了肌肉樣品隨著消除時(shí)間的延長(zhǎng)，肌肉中對(duì)映體比例波動(dòng)較小。

3.3 單一對(duì)映體實(shí)驗(yàn) 本研究首次通過單一對(duì)映體實(shí)驗(yàn)明確了克倫特羅對(duì)映體在豬體內(nèi)不存在對(duì)映體轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。同時(shí)從0 d測(cè)定結(jié)果可知，豬內(nèi)臟器官中肺臟和肝臟中克倫特羅含量最高，且不同個(gè)體之間兩者存在較大差異，有的肺臟中克倫特羅含量比肝臟中高，而有的個(gè)體肝臟中克倫特羅含量比肺臟中高。

本研究通過分離和制備了克倫特羅單一對(duì)映異構(gòu)體，獲得的(-)-對(duì)映體和(+)-對(duì)映體質(zhì)量分別為74.95、76.45 mg。通過飼喂含有鹽酸克倫特羅外消旋體、單一對(duì)映體的飼料，進(jìn)行了外消旋體和單一對(duì)映體在豬體內(nèi)的立體選擇性降解試驗(yàn)，分析不同時(shí)間采集的樣品可知克倫特羅在豬體內(nèi)代謝存在立體選擇性，其中左旋異構(gòu)體代謝較快，特別是在肝臟、腎臟和肺臟組織中所占比例較小，因此在科學(xué)評(píng)估肝臟、腎臟和肺臟組織中殘存的該藥物對(duì)人體健康造成的危害時(shí)，有必要對(duì)其進(jìn)行對(duì)映異構(gòu)體分析；同時(shí)單一對(duì)映體在豬體內(nèi)不存在轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。

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(編輯：侯向輝)

Study on the Stereochemical Degradation of Clenbuterol in Swine Edible Tissues

YU Zun-bo,ZHANG Yan2,WU Yin-Liang2*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China;2.TheNingboAcademyofAgriculturalSciences，Zhejiang，Ningbo315040,China)

Two single enantiomers had been acquired by chiral separation to investigate whether there is a stereochemical degradation behavior in swine tissues for clenbuterol.Then,experiments were carried out in swine by feeding diets with 2.0 mg/kg of clenbuterol and 1.0 mg/kg of its single clenbuterol enantiomer for consecutive 7 days,respectively.After 7 d,the swine tissues (muscle,heart,lung,liver and kidney) and urine samples were collected regularly,and the content of clenbuterol enantimers had been determined by LC-MS/MS.After residual data analysis,there is stereochemical degradation behavior in swine tissues for clenbuterol.The ratio of (+) stereoisomer/(-) stereoisomer is higher than 1.5 for most of liver,lung and kidney samples when the swine had been fed with clenbuterol diets; and the ratio of (+) stereoisomer/(-) stereoisomer is between 0.8 and 1.25 for muscle and heart samples.For liver,kidney and urine samples,the ratio of (+) stereoisomer/(-) stereoisomer is highest at 3 d interval.Moverover,there is not mutual transformation for clenbuterol enantiomer in swine tissues.Finally,the experiment provide scientific basis for scientific assessment of damage of residual clenbuterol in animal derived food.

clenbuterol; enantiomers; stereochemical degradation；liquid chromatography with tandem mass spectrometry

寧波市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013C11003)

于遵波，獸醫(yī)師，博士，從事獸藥安全性評(píng)估研究。

吳銀良。E-mail：wupaddyfield@sina.com

2015-10-12

A

1002-1280 (2015) 12-0027-05

S859.84